1. Fácil Manipulação
2. Células Pequenas
3. plásmideo e Bacteriofago
3.1. Plásmideo
3.1.1. Foram os primeiros vectores a serem utilizados na clonagem de genes.
3.1.2. O plasmídeo deve transportar um ou mais genes que lhe confiram propriedades particulares, como a resistência a certos antibióticos como o Cloranfenicol e a Ampicilina que possam servir como indicadores selecionáveis
3.1.3. O plasmídeo deve possuir pelo menos uma sequência de ADN que possa atuar como origem de replicação, de modo a que seja capaz de se multiplicar independentemente dos cromossomas bacterianos.
3.1.4. o plasmídeo deve ter apenas um local de reconhecimento onde as endonucleases o irão cortar. Se não tiver esse local, o plasmídeo não pode ser aberto para a inserção de novos genes.
3.2. Bacteriofago
3.2.1. Os bacteriófagos são vírus que infectam especificamente as bactérias.
3.2.2. Têm uma estrutura muito simples
3.2.3. Possuem o ciclo litico
4. Vetores de clonagem para outros orgamismos
4.1. Em algumas circunstâncias, pode ser desejável utilizar outros hospedeiros para as experiências de clonagem de genes. Isto torna-se evidente em biotecnologia em que o objectivo não é estudar um gene, mas sim utilizar a clonagem para controlar ou melhorar a síntese de um produto metabólico importante, (por exemplo, uma hormona como a insulina) ou então para alterar as propriedades do organismo (por exemplo, para introduzir a resistência a herbicidas numa planta de cultivo).
4.2. Vetores para leveduras e outros fungos
4.2.1. A levedura Saccharomyces cerevisiae é um dos organismos mais importantes em biotecnologia. Para além do seu importante papel no fabrico da cerveja e do pão, as leveduras têm sido utilizadas como organismos hospedeiros para a produção de produtos farmacêuticos a partir de genes clonados. O desenvolvimento de vectores de clonagem para leveduras foi muito estimulado com a descoberta de um plasmídeo com 2 m, presente na maioria das estirpes de Saccharomyces cerevisiae
4.2.2. Plasmídeos epissomais
4.2.2.1. Os vectores derivados do círculo de 2 m são chamados plasmídeos epissomais de leveduras ou YEps. Alguns YEps contêm a totalidade do plasmídeo de 2 m e outros incluem apenas a origem de replicação do círculo de 2 m. Um exemplo deste último tipo é o YEp 13
4.2.3. Outros tipos de vectores de clonagem de leveduras
4.2.3.1. Plasmídeos integrativos de leveduras (YIps)
4.2.3.1.1. Estes são basicamente plasmídeos bacterianos que transportam um gene de levedura. Um YIp não pode replicar-se como um plasmídeo uma vez que não contém qualquer parte do circulo de 2 m, mas depende da integração do ADN cromossomal da levedura para a sua sobrevivência
4.2.3.2. Plasmídeos replicativos de leveduras (YRps)
4.2.3.2.1. Estes são capazes de se multiplicarem como plasmídeos independentes porque transportam uma sequência de ADN cromossomal que inclui uma origem de replicação. Sabe-se que as origens de replicação estão localizadas muito perto de vários genes de leveduras, incluindo um ou dois que possam ser utilizados como marcadores seleccionáveis.
4.3. Vectores de clonagem para plantas superiores
4.3.1. A utilização de plantas superiores como organismos hospedeiros para a clonagem de genes apresenta benefícios potenciais muito importantes, pois através da clonagem de genes já foi possível produzir plantas resistentes a vírus e a insectos, havendo também tomates aos quais foram melhoradas as propriedades de armazenamento e que se podem encontrar em qualquer supermercado.
4.3.2. Têm sido utilizados três sistemas de vectores com vários graus de sucesso nas plantas superiores:
4.3.2.1. Vectores baseados em plasmídeos de ocorrência natural de Agrobacterium.
4.3.2.1.1. Embora não se conheçam plasmídeos de ocorrência natural em plantas superiores, há um plasmídeo bacteriano, o plasmídeo Ti da A. tumefaciens, que se mostra de grande importância. Esta bactéria é um microorganismo do solo que provoca um tumor bacteriano (crown gall) em muitas espécies de plantas dicotiledóneas. Este tipo de tumor ocorre quando uma ferida no caule permite à bactéria A. tumefaciens invadir a planta. Após a infecção a bactéria causa uma proliferação cancerosa do tecido do caule na região do colo A capacidade de provocar o tumor bacteriano está associada à presença do plasmídeo Ti (Tumour Inducing) nas células bacterianas. É um plasmídeo grande, superior a 200 Kb, que transporta numerosos genes envolvidos no processo de infecção. Uma das principais características do plasmídeo Ti é que, após a infecção, uma parte da molécula é integrada no ADN cromossomal da planta. Este segmento, chamado de T-ADN, tem entre 15 e 30 Kb de comprimento, dependendo da cadeia.
4.3.2.2. Clonar genes em plantas por transferência directa de genes
4.3.2.2.1. A transferência directa de genes é baseada na observação de que um plasmídeo bacteriano super-enrolado, embora incapaz de se auto-replicar no interior de uma célula vegetal, pode ser integrado por recombinação em um dos cromossomas da planta. A recombinação está muito mal compreendida mas é quase de certeza distinta dos processos responsáveis pela integração do T-ADN.
4.3.2.3. A utilização de vírus de plantas como vectores de clonagem
4.3.2.3.1. Versões modificadas de bacteriófagos e M13 são vectores de clonagem importantes para a E. coli, e muitos vectores animais são baseados em vírus. Atendendo a que a maioria das plantas estão sujeitas a infecções virais, era de supor que os vírus poderiam ser também utilizados para clonar genes em plantas, no entanto, esta possibilidade tem sido explorada há alguns anos sem grande sucesso. Um dos maiores problemas deve-se ao facto de uma vasta maioria dos vírus de plantas possuirem genomas de ARN e não de ADN. Os vírus com ARN não são tão úteis como vectores de clonagem porque a manipulação do ARN é muito mais difícil de executar.
4.4. Vectores de clonagem para células animais
4.4.1. Tem havido um forte investimento no desenvolvimento de sistemas de vectores para clonar genes em células animais. Estes vectores são necessários em biotecnologia para a síntese de proteínas a partir de genes que não funcionam correctamente quando clonados em E. coli ou leveduras.
4.4.2. Vectores baseados em vírus animais
4.4.2.1. A primeira experiência de clonagem envolvendo células animais ocorreu em 1979 com um vector baseado no vírus símio 40 (SV40). Este vírus é capaz de infectar várias espécies de mamíferos segundo o ciclo lítico em alguns hospedeiros e o ciclo lisogénico em outros. O SV40 sofre do mesmo problema que e os caulimovírus das plantas em que os constrangimentos do empacotamento limitam a quantidade de ADN novo que pode ser inserido no genoma. Assim sendo, a clonagem com o SV40 implica a substituição de um ou mais genes existentes pelo ADN a ser clonado.
5. Veiculo de Clonagem de Genes
6. Replicação em Célula Hospedeira
7. Vetores de Clonagem para E.coli
7.1. São vetores de clonagem mais simples e os mais utilizados na clonagem de genes, são os baseados em pequenos plasmídeos bacterianos
7.2. Vectores de Clonagem baseados no bacteriófago M13
7.2.1. No M13 a situação no que respeita à replicação, é mais complexa As moléculas de ADN dos fagos transportam vários genes essenciais para a replicação, incluindo genes que codificam componentes da capa proteica do fago e enzimas replicatórias especificas de ADN.
7.2.2. O genoma normal de M13 tem 6,4 Kb de comprimen-to, mas a maioria é ocupada por dez genes agrupados. sendo cada um essencial para a replicação do fago. Há apenas uma pequena sequência intergénica constituída por cerca de 507 nucleótidos, na qual se poderá inserir ADN novo sem quebrar qualquer gene e além disso, esta região inclui a origem de replicação que deverá também manter-se intacta. Torna-se assim bem evidente a grande limitação para a alteração do genoma de M13.
7.3. Vectores híbridos plasmídeo-M13
7.3.1. os vetores de M13 sejam muito úteis para a produção de versões de cadeia simples de genes clonados, apresentam a desvantagem do curto tamanho do fragmento de ADN que pode ser clonado com um vector de M13
7.4. Vectores de clonagem baseados no bacteriófago
7.4.1. a molécula de ADN apenas pode ser aumentada em cerca de 5%, representando a adição de apenas 3 Kb de ADN novo.
7.4.2. o genoma é tão grande que possui mais de uma frequência de reconhecimento para praticamente todas as endonucleases de restrição
7.4.3. Estes vectores têm como principal utilidade a clonagem de fragmentos grandes de ADN, desde as 5 Kb até aos 25 Kb, que seriam demasiado grandes para serem tratados em plasmídeos ou por vectores M13.
7.4.4. Vetores de inserção e de substituição
7.4.4.1. Um vector de inserção possui, pelo menos, um único local de restrição no qual se pode inserir ADN novo. O tamanho do fragmento de ADN que um vetor individual pode transportar depende da quantidade da região "não essencial" que foi retirada
7.4.5. Vetores de substituição
7.4.5.1. Um vetor de substituição tem dois locais de reconhecimento para aendonuclease de restrição utilizada para a clonagem. Estes locais flanqueiam o segmento de ADN que é substituído pelo ADN do ser clonado. Normalmente o fragmento substituível transporta locais de restrições adicionais que podem ser utilizadas para cortá-lo em bocados mais pequenos, de modo a que sua reinserção durante a experiência de clonagem seja muito improvável. Os vectores de substituição são geralmente destinados para transportar porções de ADN maiores do que os vectores de inserção seriam capazes de lidar.
7.4.6. Cosmídeos
7.4.6.1. O mais recente e mais sofisticado tipo de vetor baseado em é o cosmídeo. Este é o resultado da hibridação entre uma molécula de ADN de um fago e um plasmídeo bacteriano. Devem esta designação ao facto das enzimas responsáveis pela ligação da molécula de ADN de na membrana proteica necessitarem apenas de locais cos para funcionar. Um cosmídeo é basicamente um plasmídeo que contém um local cos. Precisa de um marcador selecionável, tal como o gene de resistência à ampicilina e uma origem de replicação plasmídica, pois aos cosmídeos faltam todos os genes de , não produzindo assim placas. Em vez disso as colónias são formadas em meios selectivos, tal como acontece com os vectores plasmídicos.
7.5. Vetores de alta capacidade
7.5.1. Durante os últimos anos, têm-se feito vários progressos no desenvolvimento de vetores de alta capacidade. Um desses novos vetores é baseado no bacteriófago P1 que tem a vantagem de poder introduzir 110 Kb de ADN no seu cápside. Vectores do tipo cosmídeo baseados em P1 têm sido destinados e utilizados para clonar fragmentos desde os 75 Kb e os 100 Kb.
7.6. Vetores para outras bacterias
7.6.1. Têm sido também desenvolvidos vectores de clonagem para várias outras espécies de bactérias, incluindo Streptomyces, Bacillus e Pseudomonas. Alguns destes vectores são baseados em plasmídeos específicos ao organismo hospedeiro e outros são baseados em plasmídeos capazes de se replicarem numa variedade de hospedeiros bacterianos.