1. PRINCIPAIS APLICAÇÕES
1.1. identificação e tratamento de doenças condicionadas geneticamente.
1.2. diagnóstico muito sensível e específico de doenças infecciosas e parasitárias e câncer.
1.3. Teste de paternidade.
1.4. Medicina legal.
2. COMPONENTES PARA REALIZAÇÃO DO PROCEDIMENTO
2.1. Tubo
2.1.1. Primer
2.1.1.1. Deve-se planejar cuidadosamente a sequencia
2.1.1.2. Ponto de fusão médio é importante - temperatura que metade dos iniciados estão anelados
2.1.1.2.1. Cada primer tem seu Tm
2.1.2. DNA pol. (Taq)
2.1.2.1. Deve sempre operar sob as condições de reação instituídas
2.1.2.2. Taq: mais utlizada
2.1.2.3. Existem outras: Gold, Platinum
2.1.2.3.1. Vendidas em concentrações levemente maiores = maior eficácia
2.1.3. MgCl2
2.1.4. dNTPs
2.1.5. DNA molde
2.1.5.1. Deve ser na concentração correta
2.1.5.1.1. Contaminações devem ser levadas em conta e evitadas ao máximo
2.2. Termociclador
2.3. Gel
2.3.1. Poliacrilamida
2.3.1.1. Forma "malha" mais fechada
2.3.1.1.1. PCR < 500 bp
2.3.2. Agarose
2.3.2.1. Forma "malha" mais espaçada
2.3.2.1.1. PCR > 500bp
3. ETAPAS
3.1. 1- Desnaturação inicial: 4' a 95ºC
3.1.1. Separação da dupla fita (rompe as ligações de H)
3.2. 2- Desnaturação: 1' a 95°C
3.3. 3- Anelamento: 1' a 90" (em torno de 55ºC)
3.3.1. Ligação do primer
3.4. 4- Extensão: 1' a 72ºC
3.4.1. Síntese da nova fita
3.5. 5- Extensão final: costuma-se acrescentar 4' a 72°C como oportunidade adicional
3.6. 6- Final: termociclador em Hold, mantem as amostras conservadas
4. VARIAÇÕES
4.1. RT - PCR (PCR - transcripitase reversa)
4.1.1. Extrai RNA com um kit
4.1.1.1. RNA total (RNAm + RNAt + RNAr)
4.1.1.1.1. Usaremos o RNAm (identificado pela cauda poli A)
4.1.2. Transcriptase reversa (converte RNA em DNA - vai junto com os outros componentes)
4.1.2.1. liga no Poli T
4.1.2.1.1. Hidrólise alcalina - degrada a fita de RNA (molde)
4.2. PCR em tempo real
4.2.1. Serve para monitoramento de tratamento (faz antes e após um período de tratamento)
4.2.2. Podemos quantificar o nº de amplificações
4.2.3. Não deixa de ser qualitativo
4.2.4. + sensível
4.2.5. Consegue identificar o menor n° de amplificações
4.2.6. Fases
4.2.6.1. Geométrica: 2-4-8-16-32
4.2.6.2. Linear: aumenta em menor quantidade
4.2.6.3. Platô: depende do nº de ciclos. Não aumentará mais.
4.2.7. Não faz eletroforese
4.2.8. Menor tempo de reação
4.2.9. SYBERGREEN
4.2.9.1. Detecta o produto gerado na amplificação com o corante fluorescente
4.2.9.1.1. Fluoróforo
4.2.9.2. Inespecífico
4.2.9.3. Tudo acontece no equipamento
4.2.9.4. Se liga ao DNA recém sintetizado
4.2.9.5. Desvantagem
4.2.9.5.1. Intercala em QUALQUER DNA dupla fita
4.2.9.5.2. DÍMERO DE PRIMER
4.2.10. TaqMan
4.2.10.1. Componentes
4.2.10.1.1. dNTPs
4.2.10.1.2. Primer
4.2.10.1.3. Taq
4.2.10.1.4. Tampão
4.2.10.1.5. DNA molde
4.2.10.1.6. H2O
4.2.10.1.7. Sonda (probe)
4.2.10.2. Passos
4.2.10.2.1. Fita simples (desnaturada)
4.2.10.3. Vantagem: Multiplex
4.2.10.3.1. 1 sonda em cada região com repórter diferente
4.3. Nested PCR
4.3.1. Aumenta a sensibilidade e especificidade do método
4.3.1.1. Usa 2 pares de primers (obrigatoriamente)
4.3.1.1.1. 1- região externa
4.3.1.1.2. 2- região mais externa ainda
4.3.1.2. Usado quando o menor [DNA]
4.3.2. Geralmente usada no produto de uma PCR
4.3.2.1. Fazemos a 1ª reação e transferimos poucos microlitros para um tubo e refazemos o NESTED
4.3.3. Gastamos o dobro de tempo para visualizar no gel após a eletroforese.
4.4. PCR Multiplex
4.4.1. Detecta múltiplas sequências-alvo numa mesma amostra
4.4.2. Amplifica várias regiões/sequências ao mesmo tempo
4.4.3. Componentes
4.4.3.1. DNA
4.4.3.2. dNTPs
4.4.3.3. Tampão
4.4.3.4. H2O
4.4.3.5. Taq
4.4.3.6. VÁRIOS Primers
4.4.3.6.1. Ex.: Primer 1 - 55°C Primer 2 - 60°C Primer 3 - 50°C
4.4.4. Reconhecer e discriminar infecções simultaneas
4.4.5. Teste de paternidade
4.4.6. Caracterizar simultaneamente mais que um fator de resistência à fármacos
4.4.7. Desvantagem
4.4.7.1. Excesso de Primers
4.4.7.1.1. Dímero de primer
4.4.8. Vantagem
4.4.8.1. Detecção e análise de múltiplos genes de uma amostra ao mesmo tempo
4.4.8.2. Mais econômico e mais rápido
4.4.8.3. Uso de um controle interno nos ensaios diagnósticos, não sendo necessário contro externo
5. O QUE É
5.1. Copiar uma região específica de um genoma utilizando-se uma DNA polimerase.
6. OBJETIVO
6.1. Aumentar o número de cópias do DNA a ser estudado.
7. OBSERVAÇÕES
7.1. Precisamos das quantidades corretas de todos os componentes
7.1.1. Pouco DNA é necessário
7.1.2. Alta [Taq]: amplificações inespecíficas / Baixa {Taq]: baixa eficiência
7.1.2.1. [Taq] ÓTIMA: 1 a 2,5 unidades
7.1.3. Mg afeta a temp. de desnaturação, pareamento do primer e fidelidade e atividade da enzima
7.1.3.1. [Mg} ÓTIMA: 0,5 a 4,5 mM
7.1.4. Alta [dNTPs]: baixa especificidade / Baixa [dNTPs]: pouco rendimento do produto
7.1.4.1. [dNTPs} ÓTIMA: 20 a 200 nM
7.1.5. Primers maiores são mais específicos
7.1.5.1. ÓTIMO: 15-30pb
7.2. Precisamos testar as quantidades antes de realizar o procedimento oficial
7.3. Em geral, 30 ciclos
7.3.1. Desnaturação: 30" a 1'
7.3.2. Pareamento: 30" a 1'
7.3.3. Extensão: tamanho do fragmento (até 1000bp - 1' / +1000bp - +1')
7.4. Eletroforese
7.4.1. Migração de partículas utilizando o gel, em função da aplicação de um campo elétrico
7.4.1.1. Agarose
7.4.1.1.1. Brometo de etídio
7.4.1.1.2. Horizontal
7.4.1.2. Poliacrilamida
7.4.1.2.1. Vertical
7.4.1.2.2. Persulfato de amônia
7.4.2. Amostra é aplicada ao gel
7.4.2.1. A fonte de eletroforese cria a corrente elétrica que ocasiona a migração
7.4.2.1.1. Quanto maior a a molécula, mais lento o processo
7.4.3. Aplicações
7.4.3.1. Ciência forense
7.4.3.1.1. comparar DNA
7.4.3.2. Genética
7.4.3.2.1. Teste de paternidade
7.4.3.3. Microbiologia
7.4.3.3.1. Detecção de diferentes patógenos
7.4.3.4. Bioquímica
7.4.3.4.1. detecção da expressão de proteínas
7.4.4. Equipamento/Reagentes