1. Sequenciamento do DNA
1.1. diz a sequência de aminoácidos codificada a partir de um gene
1.2. alálogos quimicos
1.2.1. A, T, G, C
1.2.2. Didesoxinucleotíedos
1.2.2.1. ddA,ddT,ddG,ddC
1.2.2.2. sem 3’-hidroxila
1.2.2.2.1. impede a DNA Polimerase de se ligar a próxima base complementar
1.3. sequenciadores automáticos
1.3.1. cada dideoxi é marcado por um fluorocromo
1.3.1.1. serão detectados por um sistema óptico
1.3.2. menor fita
1.3.2.1. 5'
1.3.3. maior fita
1.3.3.1. 3'
2. DNA recombinante
2.1. clonagem molecular
2.1.1. vetor ---> hospedeiro ---> utilização
2.1.2. enzima de restrição
2.1.2.1. corta
2.1.2.1.1. DNA
2.1.2.1.2. plasmídeo
2.1.2.2. sequencias palindromicas
2.1.2.2.1. sítios de restrição
2.1.3. etapas
2.1.3.1. digestão
2.1.3.1.1. quebra do DNA e plasmídeo pela enzima
2.1.3.2. ligação
2.1.3.2.1. <--- DNA ligase
2.1.3.3. transformação
2.1.3.3.1. = bác. recebe o material genético do meio
2.1.3.4. seleção dos transformantes
2.1.3.4.1. colônia de bác.
3. Técnicas Avançadas
3.1. RNA interference
3.1.1. silenciamento gênico
3.1.1.1. "bloqueia" a tradução e transcrição
3.2. microarranjo
3.2.1. chip com genoma
3.2.1.1. ác nucleicos fixados em centenas de milhares de SPOTS
3.2.1.1.1. mostra quais genes estão ativos ou inativos
3.2.1.1.2. a luz de cada SPOT é quantificada
3.3. CRISPR-CAS9
3.3.1. imunidade das bactérias contra os bacteriófagos
3.3.1.1. CAS9 produz complexo CAS
3.3.1.1.1. quebra o DNA viral
3.3.2. engenharia genética
3.3.2.1. humanos?
4. Polimorfismo
4.1. mutação ≠ polimorfismo (>1%)
4.1.1. não causa doença letal
4.2. variações na sequencia de DNA
4.2.1. mutações pontuais
4.2.2. macro-arranjos
4.2.3. contribui para a suscetibilidade à algumas doenças e resposta aos fármacos
4.3. marcadores genéticos moleculares
4.3.1. SNP
4.3.1.1. afeta uma base
4.3.2. minisatélites (VNTR)
4.3.2.1. pequenas sequências de nucleotídeos repetidas
4.3.3. microsatélites
4.3.3.1. mais repetições
4.3.3.2. <--- altamente reprodutivo
4.3.3.2.1. teste de paternidade
5. PCR
5.1. gera sequencias de DNA ilimitada
5.1.1. amplificação enzimatica
5.1.2. fragmento de DNA
5.1.2.1. localizado entre 2 primers
5.1.2.1.1. complementares: 3' e 5'
5.1.2.1.2. primers previamente desenhados
5.1.3. etapas
5.1.3.1. Taq DNA polimerase
5.1.3.2. desnaturação
5.1.3.2.1. 94º- 96º
5.1.3.3. anelamento
5.1.3.3.1. 37º- 65º
5.1.3.4. polimeração/extensão
5.1.3.4.1. 72º
5.1.4. crescimento exponencial
5.2. materiais
5.2.1. nucleotideos
5.2.2. primer
5.2.3. DNA
5.3. eletroforese
5.3.1. DNA (PCR) + corante no agar
5.3.2. eletrodos
5.3.2.1. DNA= negativo
5.3.2.1.1. ---> tende a se mover para o polo positivo
5.3.2.2. -->
5.3.2.2.1. fragmentos mais leve
5.3.2.3. -->
5.3.2.3.1. fragmentos mais pesados
6. RT-PCR
6.1. PCR através do RNA
6.1.1. etapas
6.1.1.1. transcrição reversa
6.1.1.1.1. RT = transcriptase reversa
6.1.1.2. formação de cDNA
6.1.1.2.1. fita simples
6.1.1.3. PCR
6.1.2. materiais
6.1.2.1. RNA
6.1.2.2. RT
6.1.2.3. nucleotídeos
6.1.2.4. primer (poli T)
7. Real Time
7.1. quantificação em tempo real
7.1.1. sondas TaqMan
7.1.1.1. encaixa no meio do DNA
7.1.1.2. anelamento
7.1.1.2.1. quencher= sequestrador de luz
7.1.1.2.2. reporter= fluorecente
7.1.1.3. polimeração
7.1.1.3.1. Taq é liberada/quebrada
7.1.2. síntese de uma nova fita =
7.1.2.1. intensidade da emissão fluorecente