Proteinbiochemische Methoden2

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Proteinbiochemische Methoden2 by Mind Map: Proteinbiochemische Methoden2

1. Native Gelelektrophorese

1.1. > Trennung nach Ladung und Form/Größe im elektrischen Feld > poröses Gel in ionischer Pufferlsg. > Proteinfaltung bleibt erhalten > !Handhabung und Analyse schwierig! > keine Trennung nach Masse, nur IEP und hydrodyn. Volumen

2. Proteinisolierung

2.1. Zentrifugation

2.1.1. Prinzip

2.1.1.1. Zentrifugen nutzen die Massenträgheit im Zentrifugiergutraum zur Stofftrennung. Partikel oder Medien mit höherer Dichte wandern aufgrund der höheren Trägheit nach außen. Dabei verdrängen sie die Bestandteile mit niedrigerer Dichte, die hierdurch zur Mitte gelangen. Der Prozess ist gegenüber der Sedimentation durch die Schwerkraft wesentlich schneller oder wird überhaupt erst möglich

2.1.1.1.1. Differentielle Zentrifugation

2.1.1.1.2. Dichtegradienten

2.1.2. Zentrifugation1

2.1.2.1. Prinzip

2.1.2.1.1. Zentrifugen nutzen die Massenträgheit im Zentrifugiergutraum zur Stofftrennung. Partikel oder Medien mit höherer Dichte wandern aufgrund der höheren Trägheit nach außen. Dabei verdrängen sie die Bestandteile mit niedrigerer Dichte, die hierdurch zur Mitte gelangen. Der Prozess ist gegenüber der Sedimentation durch die Schwerkraft wesentlich schneller oder wird überhaupt erst möglich

2.1.2.2. Dichtegradienten

2.1.2.2.1. Wanderung der zu Trennenden Stoffe nach außen, bis sie in dem Gradientenlösungsmittel (Dichtegradient) im Gleichgewicht stehen. Es folgt eine bessere Trennung der (mehr als 2) Phasen.

2.2. Extraktion

2.3. Fällung

2.3.1. Prinzip

2.3.1.1. Bei der Fällung wird die Sättigungskonzentration der gelösten Substanz bzw. deren Löslichkeitsprodukt überschritten, ausgelöst durch Zugabe einer leichter löslichen Substanz, Änderung der Lösungsmittel zur wässrigen oder durch Zugabe einer zweiten Reaktionslösung mit anschließender Fällungsreaktion. Die Fällungsreaktion ist eine chemische Reaktion, bei der die Edukte im vorliegenden Lösungsmittel in gelöster Form vorliegen, eines der Produkte jedoch im verwendeten Lösungsmittel unlöslich oder schwerlöslich ist und somit als Feststoff (Niederschlag) ausfällt.

2.3.2. Methoden

2.3.2.1. Aussalzen

2.3.2.1.1. Trennverfahren bei der Reinigung von Proteinen. Proteine liegen nur in Lösung vor, wenn sie über eine ausreichende Hydrathülle verfügen. Wenn Salze zugesetzt werden binden die Ionen Wassermoleküle in ihrer Hydrathülle und entziehen sie den Proteinmolekülen. Geschwindigkeit abhängig von Salz und Protein.

2.3.2.2. Isoelektrische Präzipation

2.4. Filtration

2.5. Elektrophorese

2.5.1. Isoelektrische Fokussierung

2.5.1.1. > Trennung nach positiven und negativen Ladungen innerhalb des Proteins > IEP: Punkt, an dem Molekül gleich viele positive und negative Ladungen > Moleküle wandern innerhalb pH-Gradient zu Stelle des IEP in Trenngel > alle Moleküle einer Sorte sammeln sich an einer Stelle = Fokussierung > Trennung von Isomeren möglich > Feststellen des IEP

2.5.2. SDS PAGE

2.5.2.1. > "Sodium dodecylsulfate polyacrylamid gel electrophoresis" > Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht unter denaturierenden Bedingungen > Tensid SDS überdeckt Eigenladungen der Proteine

2.6. Dialyse

2.6.1. Trennprinzip: Dichte/Größe

2.6.2. Osmose durch semipermeable Membran: Abtrennung niedermolekularer Substanzen

2.6.3. Chemgapedia Link

3. Chromatographie

3.1. Ionenaustausch-ch.

3.1.1. Ladung

3.1.1.1. Vorteile

3.1.1.2. Nachteile

3.2. Ausschluss-ch.

3.2.1. Größe/Dichte

3.2.1.1. Vorteile

3.2.1.1.1. einfache Handhabung

3.2.1.1.2. keine Denaturierung

3.2.1.2. Nachteile

3.2.1.2.1. geringe Selektivität

3.2.1.2.2. geringe Kapazität

3.3. Verteilungs-ch.

3.3.1. Hydrophobizität/ Polarität

3.3.1.1. Vorteile

3.3.1.1.1. als HPLC sehr hohe Ausflösung

3.3.1.2. Nachteile

3.3.1.2.1. Denaturierung wahrscheinlich

3.3.1.2.2. geringen Kapazität

3.3.2. Affinität

3.4. Affinitäts-ch.

3.4.1. Affinität

3.4.1.1. Vorteile

3.4.1.2. Nachteile

3.5. Prin