Expresión, purificación y cristalización del ácido (3R) -hidroxiacil-ACP deshidratasa del comple...

1. Para la expresión de la proteína recombinante GST-Hadab, las células crecieron aeróbicamente a 37ºC en 2L  de medio con caldo Terrific 100 lg mL1 ampicilina y 50 lg mL1 kanamicina.

1.1. El lisado se centrifugó a 30,700g durante 30 min a 4 C para eliminar las células intactas y los desechos.El sobrenadante se cargó en una columna con 2 ml Glutatión resina Sepharose (GE Healthcare) pre-equilibrada con Tampón A

1.1.1. La columna se lavó con 30-50 volúmenes de columna de tampón A para eliminar las proteínas no unidas y a continuación se incubaron en 10 ml de tampón A que contiene 30 lg mL1 PreScission proteasa a 4 C durante la noche Tocut fuera etiqueta GST. El día siguiente, el flujo a través que contiene se recogió el no etiquetado Hadab, y se desaló con dilusion seis veces con Tampón B (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 50 mM y 10% (v / v) de glicerol). Se purificó adicionalmente usando una columna de intercambio de aniones 5 ml HiTrap ™ Q HP (GE Healthcare) con un purificador AKTA (GE Cuidado de la salud) de la máquina a los 16 C.

2. La amplificación se llevó a cabo por un termociclador (Bio-Rad) de acuerdo con el siguiente protocolo: paso 1, 95°C durante 300 s; paso 2, 94°C durante 40 s; paso 3, 60°C durante 40 s; paso 4, 72°C durante 32 s; repita desde el paso 2 durante 30 ciclos. Los productos de PCR fueron sometido a una etapa de amplificación final de 5 min a 72°C. Electroforesis en gel de agarosa al 1%.

2.1. El producto correspondiente a Hada (500 pb) se extrajo del gel usando el kit de extracción de ADN (QIAGEN). A continuación, la purificación del producto de PCR se hidrolizó con endonucleasas NdeI y XhoI y se ligaron de acuerdo con el protocolo del fabricante con la expresión vector pRSFDuet-1 (Novagen)

3. El gen Rv0636 de la misma fuente que codifica hadb se amplificó por PCR usando cebadores pBm_F (5'CGCGGATCCATGGCGCTGCGTGAGTTCAG-3 ') y pXh_R (5'-CCGCTCGAGCTACGCTAACTTCGCCGAGG-3 '). Se utilizó BamHI y XhoI. protocolo de amplificación es el mismo como Hada. Después de la digestión de restricción, el gen se ligó en el vector pGEX-6P-1 (GE Healthcare)

3.1. Los plásmidos recombinantes pRSFDuet-1-Hada y pGEX-6P-1-hadb se co-transformaron en E. coli. BL21 (DE3) para la expresión. clon correcto se proyectó por bi anti-placa de agar y PCR y confirmado por secuenciación de ADN.

4. Metodología

5. El gen que codifica Rv0635 Hada se amplificó a partir de M. tuberculosis H37Rv ADN genómico mediante el uso de ExTaq polimerasa (Takara) como así como el primer forwar 5'-TTCCATATGGTGGCGTTGAGCGCAGACAT-3' y el primerr reverse 5'CCGCTCGAGTCACGCAGCGCCATCAGAAA-3' con los sitios de restricción NdeI y XhoI.

6. El gradiente lineal de la concentración de NaCl fue creado mediante la mezcla de tampón B y de tampón C (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl y 10% (v / v) de glicerol) por máquina purificador AKTA. Se analizaron fracciones que contenían proteína por SDS-PAGE. Las fracciones que contenían proteína diana puras se agruparon, se desalaron con Tampón B y se purificó luego adicionalmente mediante el uso de una 1 columna de intercambio aniónico ml RECURSOS ™ Q (GE Healthcare).

6.1. Después de un análisis SDS-PAGE, las fracciones que contiene pura y homogénea Hadab se reunió y se concentró por ultrafiltración utilizando dispositivo de centrífuga Amicon (Millipore). La concentración de proteínas se calculó mediante la medición de la absorbancia de la muestra a 280 nm y ajustando con su coeficiente de extinción de 1,15. purificada Hadab se concentró finalmente a 10 mg mL1 para la cristalización ensayos.

7. Dos etapas de cromatografía: de intercambio aniónico y filtración en gel, la pureza de la proteína según lo estimado por SDS-PAGE fue> 95%. Utilizando el método de difusión de vapor-gota colgante, Se obtuvieron cristales y se difractaron los rayos X a 1,75 Å de resolución. El cristal pertenece al grupo espacial P41212, con celdas unidad de parámetros a=b=82,0 Å, c=139,8 Å, a=b=c=90,0

8. Para caracterizar la importancia de HadAB desde la perspectiva de la biología estructural, gran cantidad de HadAB pura se requiere para la caracterización bioquímica y cristalización. See utilizó una expresión única y el método de purificación. Hada y hadb fueron clonados por separado y co-expresados ​​en Escherichia coli.

9. El (3R) -hidroxiacil-ACP deshidratasa HadAB,  participa en la ruta de biosíntesis de ácidos micólicos (MA) de Mycobacterium tuberculosis, cataliza la tercera etapa en el ciclo de elongación de ácidos grasos (FA), que es un objetivo ideal y real de agente anti-tuberculosa.

10. ¿Qué se hizo?

11. Resultados

11.1. El structuralmodel 3D de Hadab fue construido de acuerdo a la densidad y el refinamiento está actualmente en curso. Expectingly, la estructura cristalina de Hadab nos ayudará a comprender el mecanismo de la deshidratación sustrato, así como la biosíntesis de los ácidos micólicos, así como sentar las bases para el descubrimiento de fármacos anti-TB

12. Cristalización usando un sistema de manejo de líquidos Mosquito ™. Cada gota colgante se creó mediante la mezcla de 200 nL solución de proteína (10 mg ml) con una solución de depósito de 200 nL. Las soluciones de depósito eran de cristalización disponible comercialmente los equipos de cribado (Índice, SaltRx, PEG / Ion, PEG / Ion 2, pantalla de cristal, pantalla de cristal 2 y Natrix; Hampton Research). Los cristales aparecieron en varias condiciones después de unos pocos días.