Secuenciación de ADN

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Secuenciación de ADN by Mind Map: Secuenciación de ADN

1. Maxam & Gilbert

1.1. Fundamento

1.1.1. En este método, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los extremos 5’- 3’ de una o ambas hebras con 32P. Después, la muestra de ADN se divide en cuatro alícuotas y se fragmenta en cuatro reacciones químicas distintas. Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamaño

1.1.2. Las reacciones químicas que se utilizan para fragmentar la molécula de ADN son *Corte de las purinas *Corte de las adeninas *Corte de las citosinas *Corte de las pirimidinas

1.2. Síntesis

1.2.1. 1.- Fragmento a secuenciar se desnaturaliza. 2.-Se marca el extremo 5’ con radiactividad. 3.-La muestra se divide en 4 alícuotas tratadas con diferentes reactivos químicos que cortan al ADN en bases específicas (A, T, C, G) 4.- Queda una grupo de fragmentos de ADN de diferente tamaño que termina en una base específica. Se separan por electroforesis en gel de poliacrilamida. 5.-Se visualizan y analizan con una radiografía.

1.3. Detección

1.3.1. Se separan y analizan mediante electroforesis manual o automáticamente

2. Sanger

2.1. Fundamento

2.1.1. La secuenciación de Sanger se basa en la polimerización del ADN y el uso de dideoxinucleótidos que sirven como terminadores de la reacción

2.2. Síntesis

2.2.1. El método enzimático de Sanger, utiliza una ADN polimerasa e inhibidores que finalizan la cadena de ADN que está siendo sintetizada en lugares específicos, particularmente utiliza dideoxinucleótidos

2.2.2. 1. Se basa en la interrupción controlada de la replicación del ADN in vitro. 2. Se realiza una PCR del fragmento que se va a secuenciar→ diferente de una PCR convencional. 3. Se usa un solo iniciador y se agregan dideoxinucleótidos (ddNTPs) que no tienen grupo hidroxilo en el extremo 3’ (no permiten que la polimerasa agregue más nucleótidos) y están marcados con radiactividad o fluoróforos. 4. Al final se obtienen fragmentos de diferente longitud y cada fragmento termina en un ddNTPs.

2.3. Detección

2.3.1. Se separan y analizan mediante electroforesis manual o automáticamente.