Heptapeptide-loaded solid lipid nanoparticles for cosmetic anti-aging applications
1. METHOD >SLN-P7 preparation >ศึกษาประสิทธิภาพของ SLN-P7 1.ศึกษาประสิทธิภาพของ SLN-P7 ในการเหนี่ยวนำให้เกิด gene expression ของ antioxidant genes ในผิวหนังเพาะเลี้ยง 2.ศึกษาประสิทธิภาพของ SLN-P7 ในการป้องกันผิวหนัง เพาะเลี้ยง จากรังสี UV 3.ศึกษาประสิทธิภาพของ SLN-P7 ในการป้องกัน DNA damage จากรังสี UV ในผิวหนังมนุษย์
1.1. ศึกษาประสิทธิภาพของ SLN-P7 ในการป้องกัน DNA damage จากรังสี UV ในผิวหนังมนุษย์ (In vivo analysis of a DNA damage marker in suction blister biopsies)
1.1.1. RESULT ผิวหนังที่ได้รับ 2% SLN-P7 พบว่ามีการลดลงของ DNA damage 20% เมื่อเทียบกับ placebo - ผิวหนังที่ได้รับ 2% SLN-P7 และผิวหนังที่ได้รับ placebo มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p<0.05) >สรุปได้ว่า จากการศึกษาในมนุษย์ SLN-P7 สามารถป้องกันผิวหนังจาก UV damage ได้
1.1.2. METHOD อาสาสมัคร 10 คน (อายุ 42–64 ปี, อายุเฉลี่ย= 51.9 ปี) ที่มีผิวหนังปกติ และมี photo types I และ III - ทา 2% SLN-P7 ที่ปลายแขนด้านในและทา placebo cream ที่ปลายแขนด้านในของแขนอีกข้าง วันละ 2 ครั้งเป็นเวลา 2 สัปดาห์ - ฉายด้วย 20 J/cm2 UVA เป็นเวลา 2 ชั่วโมง - เก็บตัวอย่างด้วย suction blister technique - วัด DNA damage marker 8-hydroxy-2-deoxyguanosine (8-OHdG) ด้วย immunolabeling
1.2. ศึกษาประสิทธิภาพของ SLN-P7 ในการเหนี่ยวนำให้เกิด gene expression ของ antioxidant genes ในผิวหนังเพาะเลี้ยง (Ex vivo gene expression test on skin explants)
1.2.1. METHOD เปรียบเทียบการ expression ของ Nrf2-regulated genes บนผิวหนังเพาะเลี้ยง (abdominal biopsy) > basic o/w formulation ที่มี 2% SLN-P7 > basic o/w formulation (placebo) > control - ทา 5mg/cm2 ลงบนผิวหนังเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 6 ชม. - เก็บตัวอย่าง 3 จุดจากผิวหนังเพาะเลี้ยง - นำตัวอย่างไปแช่แข็งทันทีใน isopentane solution และเก็บที่ -80 C - ทำการสกัด RNA ออกมาจากแต่ละตัวอย่างโดยใช้ TriPureIsolation Reagent - วัด gene expression ที่เกี่ยวข้องกับ oxidative stress โดยเทคนิค PCR
1.2.2. RESULT ผิวหนังเพาะเลี้ยงที่ได้รับ SLN-P7 พบการ up-regulation ของ 3 antioxidant genes เมื่อเทียบกับ placebo > NAD(P)H: quinoneoxidoreductase (NQO1) > Heme oxygenase-1(HMOX1) > Peroxiredoxin-1(PRDX1) แสดงว่า มีการกระตุ้น genes coding ใน phaseII และมีการกระตุ้น antioxidant defense enzymes >> SLN-P7 มี activity ในการเหนี่ยวนำ genes ที่ควบคุมโดย Nrf2 transcription factor.
1.3. ศึกษาประสิทธิภาพของ SLN-P7 ในการป้องกันผิวหนังเพาะเลี้ยงจากรังสี UV (Ex vivo multi-cellular protection against UV-induced stress test on skin explants)
1.3.1. METHOD วิเคราะห์ protective effect ของ SLN-P7 ต่อ photochemical cellular damage ในผิวหนังเพาะเลี้ยง (abdominal plastic surgery) ที่เพาะเลี้ยงใน medium > 0.037% SLN-P7 > 0.11% SLN-P7 > SPF 30 sun cream (reference compound) > control - ทาลงบนผิวและใส่ลงใน medium เป็นเวลา 24 ชั่วโมง - ล้าง upper surface ด้วย phosphate buffered saline solution - ทาครีมและใส่ลงใน medium อีกครั้ง - ฉายด้วย UV (UVB 1.25 J/cm2 + UVA 18.7 J/cm2) จาก solar simulator SOL 500 - หลังจากฉายรังสีแล้ว จะมีการทำซ้ำใหม่อีกครั้งเป็นเวลา 24 ชั่วโมง > ผิวหนังเพาะเลี้ยงจะถูดตัดออกเป็นสองส่วน - paraffin-embedded skin explant - snap-frozen ใน medium.
1.3.1.1. - paraffin-embedded skin explant ย้อมด้วย Hematoxylin-Eosin-Saffron (HES) นับจำนวน sun burn cells (SBC) ใน epidermis ด้วยวิธี microscopy >>คิดอัตราส่วนของ Sunburn cells ต่อ mm2 epidermis area - frozen skin explants Langerhans cells ด้วยวิธีการ immunolabeling กับ anti-CD1a antibody โดยใช้ propidium iodide solution. วิเคราะห์โดย epifluorescence microscopy >>คิดคิดอัตราส่วนของ Langerhans cells ต่อ mm2 epidermis area
1.3.1.1.1. RESULT > จำนวนของ Langerhans cells (LC) LC มีความไวมากต่อ UV irradiation ซึ่งจะลดจำนวนลงเมื่อได้รับ UV-irradiation - การได้รับ SPF 30 sun cream และ 0.11% SLN-P7 ต่างจาก control อย่างมีนัยสำคัญ (p=0.001 to 0.01) ในการป้องกันการเกิด SBC และป้องกันการลดลงของ LC > 0.037% SLN-P7 สามารถยังยั้งการลดลงของ LC ได้ 6% > 0.11% SLN-P7 สามารถยังยั้งการลดลงของ LC ได้ 39% จึงสรุปได้ว่า SLN-P7 สามารถป้องกัน UV-irradiated ได้
1.3.1.1.2. RESULT >การเกิด sun burn cells (SBC) เป็นตัวบ่งชี้ว่าเกิด severe UV-induced cell damage - การได้รับ SLN-P7 ในผิวหนังเพาะเลี้ยง สามารถป้องกัน UV ได้อย่างมีนัยสำคัญ และคุณสมบัติการป้องกัน UV เป็นแบบ dose-dependent > 0.037% SLN-P7 สามารถยับยั้งการสร้าง SBC ได้ 20% > 0.11% SLN-P7 สามารถยับยั้งการสร้าง SBC ได้ 75%
1.4. SLN-P7 preparation - lipid phase >shea butter (60 C) >heptapeptide (acetyl-DEETGEF-OH) จะถูกกระจายใน shea butter โดยวิธี homogenization - aqueous phase >hydrated lecithin (emulsifier) >glycerol > hot high pressure homogenization > Microfluidizer ที่ความดัน 1000 bar และทำให้เย็นลงที่อุณหภูมิห้อง
1.4.1. RESULT Composition Heptapeptide (acetyl-DEETGEF) 0.014% Hydrogenated lecithin 2.0% Glycerin 33% Shea butter 13% Water ad 100% Analytical data Particle size 173 nm PdI 0.077 Zeta potential −54 mV Entrapment efficiency 90.8% Melting temperature 27 °C