1. Rotura específica del DNA
1.1. Mediante
1.1.1. Nucleasas de Restricción
1.1.1.1. ¿Qué hacen?
1.1.1.1.1. Cortan la doble cadena de la molécula de DNA en diversos tamaños
1.1.1.2. ¿Cómo lo hacen?
1.1.1.2.1. Reconocen puntos específicos a cortar definidos por una secuencia específica de nucleótidos en el DNA
1.1.1.3. ¿De dónde se consiguen?
1.1.1.3.1. Son fabricadas por bacterias para protegerse de ataques de virus
1.1.1.4. ¿Cómo puede quedan los extremos del fragmento de DNA cortado?
1.1.1.4.1. Extremos Romos
1.1.1.4.2. Extremos Cohesivos
1.1.1.5. ¿Cómo se purifica la mezcla que queda de fragmentos de distinto tamaño de DNA cortados?
1.1.1.5.1. Electroforesis en gel
1.2. Facilita
1.2.1. Aislamiento y manipulación de los genes individualmete
2. Unión del DNA
3. Clonación del DNA
3.1. Clonación
3.1.1. Puede referirse a
3.1.1.1. Acción de realizar copias genéticas idénticas
3.1.1.2. Aislamiento de un fragmento de DNA del resto del DNA de la célula
3.1.1.2.1. Se ve facilitado al realizar varias copias idénticas del DNA de interés
3.2. Mediante
3.2.1. Vectores de clonación
3.2.1.1. Virus
3.2.1.2. Plasmídico
3.2.1.2.1. ¿Qué son?
3.2.1.2.2. ¿Cómo se utilizan?
3.2.1.2.3. Con respecto al tamaño de DNA a clonar
3.2.1.2.4. Poli conector sintético
3.2.2. Reacción en cadena de la polimerasa
3.2.2.1. Permite amplificar más de mil millones de veces un DNA obtenido de una región seleccionada de un genoma
3.2.2.1.1. ¿Cómo?
3.2.2.2. Se pueden obtener clones genómicos o de cDNA
3.2.2.2.1. Se debe conocer de antemano la secuencia que quiere clonarse
3.2.2.3. Se realiza en un sistema libre de células (in vitro)
3.2.2.4. Está sustituyendo al sotuhern blot para el diagnostico de enfermedades genéticas, infección vírica, medicina forense.
3.2.2.4.1. Medicina forense
3.3. ¿Cómo se reailza?
3.3.1. Manera más sencilla
3.3.1.1. Inserción de un fragmento particular de DNA en el genoma purificado de un elemento genético autorreplicativo
3.3.1.1.1. Vectores de clonación
3.4. Biblioteca de DNA
3.4.1. Colección de fragmentos de DNA clonado a partir de células, tejidos u organismos
3.4.1.1. Incluye -probablemente- al menos un fragmento que contiene el gen de interés
3.4.2. Dos tipos
3.4.2.1. Biblioteca de DNA genómico
3.4.2.1.1. Clon de DNA genómico
3.4.2.1.2. Se guarda en un conjunto de bacterias
3.4.2.2. Biblioteca de cDNA
3.4.2.2.1. Selecciona las secuencias de DNA que se transcriben a RNA (genes)
3.4.2.2.2. Habrá una biblioteca diferente de cDNA en función del tipo celular utilizado
3.4.2.2.3. Ventajas
4. Hibridación de ácidos nucleicos
4.1. Hace posible
4.1.1. Localizar secuencias determinadas de DNA o de RNA
4.2. Mediante
4.2.1. La capacidad que tienen los ácidos nucleicos de unirse a secuencias complementarias de otros ácidos nucleicos
4.2.1.1. ¿Cómo se logra esto?
4.2.1.1.1. Sondas
4.3. Transferencias
4.3.1. Combinación de sondas de DNA con electroforesis
4.3.2. ¿Para qué sirve?
4.3.2.1. Detectar moléculas de ácidos nucleicos que tengan una secuencia complementaria a la sonda
4.3.3. ¿Cómo se hace?
4.3.3.1. 0. Si tenemos las moléculas en un tejido
4.3.3.1.1. Detergente para inactivar nucleasas
4.3.3.1.2. Proteínas se desnaturalizan y extraen con fenol
4.3.3.1.3. Acidos nucleicos precipitan en alcohol
4.3.3.1.4. mRNA se separa de RNA en una columna de cromatografía
4.3.3.2. 1, Se separan por electroforesis las moléculas de RNA o de DNA según su tamaño.
4.3.3.2.1. Hay un pocillo con moléculas patrón
4.3.3.3. 2. Se hace una transferencia (blotting) de las moléculas separadas a una hoja de nitrocelulosa
4.3.3.3.1. Se conserva el patrón de bandas en la hoja
4.3.3.3.2. Se transfieren mediante la succión de un tampón a través del gel de la electroforesis y del papel
4.3.3.4. 3. Se incuba el papel con las sondas
4.3.3.5. 4. Por autorradiografía o métodos químicos se puede determinar las moléculas que se hibridaron
4.3.3.6. 5. Podemos ver si determinada molécula tiene un tamaño y abundancia normal comparándola con el patrón de la electroforésis
4.3.4. Tipos
4.3.4.1. Northern Blotting
4.3.4.1.1. Analiza RNA
4.3.4.2. Southern Blotting
4.3.4.2.1. Analiza DNA
4.3.4.2.2. Se corta el DNA previo a la electroforesis
4.3.4.2.3. Se expone el DNA a denaturalización antes de hacer la transferencia a la hoja de nitrocelulosa
4.3.4.2.4. Mapa de Restricción
5. Secuenciación rápida de todos los nucleótidos de un fragmento purificado de DNA
5.1. Método enzimático o didedoxi
5.1.1. Pasos
5.1.1.1. 1. Desnaturar DNA que se quiere secuenciar para separar las hebras.
5.1.1.2. 2. Replicamos la cadena que se eligió secuenciar
5.1.1.2.1. Se necesita
5.1.1.3. 3. Repetimos para cada uno de los didedoxirribonucleotidos por separado
5.1.1.4. 4. Hacemos la electroforesis en 4 pocillos separados, uno para cada didedoxirribonucleotido
5.1.1.4.1. En cada carril, las bandas representan fragmentos que han terminado en un nucleotido dado, pero en posiciones diferentes de la cadena de DNA
5.1.2. Produce copias acabadas en diferentes puntos de la secuencia.
5.1.3. Está completamente automatizado por aparatos robotizados
5.2. Predicción de secuencias de aminoácidos de proteínas
5.2.1. Seis pautas de lectura para traducir la secuencia DNA a proteína
5.2.1.1. Tres en cada hebra
5.2.1.2. Pauta correcta no presenta un gran número de codones de terminación
5.2.1.2.1. Cada 20 aminoacidos
5.2.1.2.2. Si es cada más aminoacidos, es candidata a formar parte de exones
5.2.2. Determinar qué secuencias representan genes que codifican proteínas
5.2.2.1. En bacterias, arqueobacterias y cDNA
5.2.2.1.1. Más fácil porque no tienen exones
5.2.2.1.2. Se identifican buscando la secuencia de nucleótidos que proporciona una pauta de lectura abierta (ORF)
5.2.2.2. Eucariontes
5.2.2.2.1. Más dificil por la presencia de intrones insertados entre las porciones codificantes de los genes
5.2.2.2.2. Una aproximación
5.2.2.2.3. Otra aproximación
5.3. Método de la predigonada
5.3.1. Secuencias largas de DNA se cortan de forma aleatoria para generar fragmetnos de menor tamaño
5.3.1.1. Cada fragmento es secuenciado
5.3.1.2. Se ordenan los fragmentos, basandose en el solapamiento de secuencias
5.3.2. Secuenciacion en genomas de pequeño tamaño
6. Seguimiento simultáneo del nivel de mRNA producido por cada uno de los genes de la célula
7. Extra
7.1. Otro método para marcar la molécula de DNA
7.1.1. Polinucleótido quinasa de bacteriófago
7.1.1.1. Transfiere 1 solo fosfato marcado con 32P desde el ATP hasta el extremo 5'
7.1.1.2. Útil para el estudio de huellas de DNA
7.2. Vectores de expresión
7.2.1. Son plásmidos diseñados para producir una gran cantidad de mRNA estable
7.2.1.1. Para producir grandes cantidades de proteínas
7.2.1.1.1. De esta forma se secretan insulinas, hormonas, etc. para uso medicinal
7.2.1.2. Se inserta en el plásmido una secuencia de DNA que codifica una determinada proteína
7.2.2. Para prevenir la interferencia de la proteína exógena con el propio crecimiento de la celula transfectada, se diseña de modo que la sítesis del RNA y de la proteína exógena puede retrasarse hasta poco antes de la recolección de las células.
7.2.3. Purificación
7.2.3.1. La purificación de la proteína se consigue fácilmente dado que es la más abundante de la célula
7.2.3.2. Se incorpora una etiqueta molecular a la proteína expresada, para purificar por cromatografía de afinidad
7.2.4. También sirve para producir grandes cantidades de cualquier molécula de RNA pura
7.3. Síntesis química
7.3.1. Sintetizar de forma directa secuencias específicas de aminoácidos y ácidos nucleicos
7.3.2. Método de elección para obtener ácidos nucleicos en el rango inferior a 100 nucleótidos
7.3.3. Se usa mucas veces para producir pé´tidos específicos que, cuando están químicamente acoplados a toras proteínas, se utilizan para producir anticuerpos contra el propio péptido
8. Tipos de enzimas usadas en tecnologia DNA recombinante
9. Microchips
9.1. Útil para
9.1.1. Análisis genómico, análisis transcriptómico y el análisis proteómico
9.2. Permite
9.2.1. Estudiar transcriptos de un mismo organismos en diferentes estados de su desarrollo
9.2.1.1. Ver fluorescencias de diferentes colores y estos colores identifican los cambios o no cambios en las expresiones a lo largo del desarrollo
9.3. Confección del chip
9.3.1. Trozos de DNA de genes conocidos se amplifican por PCR y se fijan sobre una superficie sólida
9.3.2. Hasta un millón de muestras son depositadas en un casillero que mide pocos cm
9.4. ¿Cómo funciona?
9.4.1. Se aísla el mRNA de la célula que quiere analizarse los genes
9.4.2. Se convierten en cDNA fluorescente usando transcriptasa inversa
9.4.3. Se meten en el microchip y se hibridarán con secuencias complementarias, revelando si el gen se expresa o no en esas células y en qué cantidad
10. RNA interferente
10.1. Permite
10.1.1. Silenciamiento post-traduccional
10.1.1.1. Remodelar la cromatina,, bloquear la síntesis de proteínas, unirse específicamente al ARNm e incluso degradarlo
10.2. RNA de doble cadena inducen destrucción de los mRNA con la misma secuencia
10.3. mRNA interferente primordial sale del núcleo y puede ser procesado para generar
10.3.1. siRNA
10.3.1.1. 1. Dicer corta un pequeño fragmento del iRNA primordial
10.3.1.2. 2. Pasa por un complejo proteínico RISC que elimina una de sus hebras, dejando solo una parte que sería el siRNA
10.3.1.2.1. RISC = proteínas agronautas
10.3.1.3. 4. Se une al mRNA y lo corta
10.3.1.3.1. Actividad ribonucleasa
10.3.2. miRNA
10.3.2.1. 1. Dicer corta fragmento
10.3.2.2. 2. Pasa por un complejo miRISC que elimina una de sus hebras, dejando solo el miRNA
10.3.2.3. 3. Otro complejo proteíco reconoce el mRNA blanco y bloquean la síntesis de proteínas
10.4. Aplicaciones clínicas
10.4.1. Ratones con hepatitis
10.4.1.1. Mueren por la activación de un receptor Fas
10.4.1.1.1. Se inyecta un siRNA cuyo blanco es el Fas y lo destruye
10.4.1.1.2. Ratones se tornan mas resistentes al desarrollo de la hepatitis fulminante