Heterologous expression of Trametes versicolor laccase in Saccharomyces cerevisiae

1. Resultados

1.1. Expresión de cvl3 en S.cerevisiae

1.1.1. Sustratos inductores

1.1.1.1. Glucosa

1.1.1.1.1. + lacasa cuando aumento glucosa de 2% - 4%

1.1.1.2. Sulfato de cobre penta hidratado

1.1.1.2.1. Concentración óptima

1.1.2. Densidad óptica

1.1.2.1. 2 OD(660)

1.1.2.1.1. óptima

1.1.2.2. 20 OD(660)

1.1.2.2.1. Misma expresión que 2-5 OD(660)

1.1.3. Aumentando la aireación

1.1.3.1. Nivel de expresión

1.1.3.1.1. 80 U/litro

1.2. Caracterizaciones de la lacasa recombinante

1.2.1. Actividad específica

1.2.1.1. 170 U/mg vs ABTS

1.2.1.1.1. 5.4 (purificación del plegado)

1.2.2. Lacasa producida

1.2.2.1. 210 mg/L

1.2.3. Zimograma

1.2.3.1. Tamaño

1.2.3.1.1. Más larga que la nativa

1.2.4. SDS-PAGE y Zimograma

1.2.4.1. Masa molecular

1.2.4.1.1. Recombinante

1.2.4.1.2. Nativa

1.2.5. Km

1.2.5.1. Higher than the native (32.7 ± 2 mM vs 23.8 ± 1 mM)

1.3. Conclusiones

1.3.1. Propiedades constantes en nativa y recombinante

1.3.1.1. Resistencia a la temperatura

1.3.1.2. pH óptimo

1.3.2. Propiedades diferentes en recombinante

1.3.2.1. Menos afinidad por el substrato

2. ¿Qué se hizo?

2.1. Expresión heteróloga

2.1.1. De:

2.1.1.1. Trametes versicolor

2.1.2. En:

2.1.2.1. Saccharomyces cerevisiae

2.2. Expresión de una proteína

2.2.1. Lacasa III

2.3. Construcción del plásmido

2.4. Transfección de Saccharomyces cerevisiae

2.5. Purificación de las proteínas

2.5.1. Recombinante

2.5.2. Nativa

2.6. Caracterización de la lacasa recombinante

2.7. Ensayo de actividad de la lacasa

3. ¿Cómo se hizo? (Protocolo)

3.1. Manipulación del ADN

3.1.1. Célula hospedera

3.1.1.1. Escherichia Coli

3.1.2. Enzimas

3.1.2.1. Para:

3.1.2.1.1. ADN

3.1.2.1.2. Proteínas

3.1.3. Reactivos

3.1.3.1. Proporcionados por:

3.1.3.1.1. New England Biolabs

3.1.3.1.2. Takara Bio

3.1.3.1.3. Promega

3.1.3.1.4. Nippon gene

3.2. Construcción del plásmido

3.2.1. Plásmido

3.2.1.1. pYES2

3.2.2. Gen de interés

3.2.2.1. Coriolus versicolor CVL3

3.2.2.2. GenBank

3.2.2.2.1. D13372

3.2.3. PCR

3.2.3.1. Gen de interés

3.2.3.2. Péptido señal

3.2.3.2.1. 21 aminoácidos desde el N-terminal

3.2.3.3. Cebadores

3.2.3.3.1. Forward

3.2.3.3.2. Reverse

3.2.3.4. Templado

3.2.3.4.1. pTFL3

3.2.4. Enzimas de restricción

3.2.4.1. HindIII

3.2.4.2. EcoRI

3.2.5. Promotor

3.2.5.1. GAL1

3.2.6. Terminador

3.2.6.1. CYC1

3.3. Transfección de la levadura y condiciones del medio

3.3.1. Método

3.3.1.1. Acetato de litio

3.3.2. Colonias transformantes

3.3.2.1. Levadura con uracil auxotrofia

3.3.2.2. Condiciones de cultivo

3.3.2.2.1. Medio SC

3.3.2.2.2. 0.67% YNB sin aminoácidos

3.3.2.2.3. 0.197% Ura dropout mixture

3.3.2.2.4. 2% Glucosa

3.3.3. Confirmación por PCR

3.3.3.1. Cebadores específicos para:

3.3.3.2. Condiciones de cultivo

3.3.3.2.1. Medio SC

3.3.3.2.2. 30º C

3.3.3.2.3. 2% Rafinosa

3.3.3.2.4. Hasta un OD(660) de 1.8

3.3.4. Recolección de las células

3.3.4.1. Método

3.3.4.1.1. Centrifugación

3.3.4.2. Condiciones de cultivo

3.3.4.2.1. Medio SC con galactosa

3.3.4.2.2. Inducción de lacasa

3.3.4.2.3. 20º C

3.3.5. Análisis de la densidad celular y la producción de lacasa

3.3.5.1. Matraz aforado (300ml)

3.3.5.2. Agitación de 30 ml cultivo

3.3.5.3. 160 rpm

3.3.5.4. Diferentes densidades de inóculo

3.3.5.5. Investigación de las diferentes concentraciones de galactosa y cobre

3.4. Ensayo de la actividad de la lacasa

3.4.1. Centrifugación de los cultivos obtenidos

3.4.2. Medición de la actividad de la lacasa

3.4.2.1. Se realizó en el sobrenadante

3.4.2.2. Oxidación de 0.5 mM 2, 20-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS)

3.4.2.2.1. En:

3.4.2.3. Lectura al espectrofotómetro

3.4.2.3.1. Absorbancia

3.4.2.3.2. A 420 nm (ε420 nm: 36,000 M-1 cm-1)

3.4.2.3.3. 25º C

3.4.2.4. De acuerdo a la velocidad lineal inicial

3.4.2.5. Unidades:

3.4.2.5.1. 1 micromol de sustrato oxidado por minuto.

3.5. Purificación de la lacasa nativa y recombinante

3.5.1. Lacasa recombinante

3.5.1.1. Filtración (0.45 micrómetros)

3.5.1.1.1. Producto

3.5.1.2. Ultrafiltración (50kDa)

3.5.1.3. Columna Sephadex-G75

3.5.1.3.1. Buffer

3.5.1.4. Recolección de la fracción con actividad oxidan (ABTS)

3.5.1.4.1. Producto

3.5.1.5. Utrafiltración (10kDa)

3.5.1.6. Columna TOYOPEARL DEAE-650M

3.5.1.7. Elución por gradiente lineal

3.5.1.7.1. 0-200mM NaCl en buffer

3.5.1.8. Recolección de la fracción con actividad de lacasa con buffer

3.5.1.9. Determinación de la concentración de la proteína

3.5.1.9.1. Curva de calibración

3.5.1.9.2. Micro ensayo BCA

3.5.2. Lacasa nativa

3.5.2.1. Método

3.6. Caracterización de la lacasa recombinante

3.6.1. Desglicolización

3.6.1.1. Endoglucosidasa H

3.6.1.2. PNGasa

3.6.1.3. O-glucosidasa

3.6.1.4. Condiciones:

3.6.1.4.1. Desnaturalizantes

3.6.1.4.2. No denaturalizantes

3.6.1.4.3. 37º C

3.6.1.4.4. 24 hrs.

3.6.2. Lacasa desnaturalizada (1 microgramos)

3.6.2.1. SDS-PAGE

3.6.2.1.1. Desglicolización

3.6.2.1.2. Análisis de la cadena glicosilación

3.6.2.1.3. Tinción con CBB

3.6.3. Lacasa sin desnaturalizar (24 nano gramos)

3.6.3.1. Endoglucosidasa H

3.6.3.1.1. Desglicolización

3.6.3.2. PAGE nativa

3.6.3.2.1. Separación

3.6.3.2.2. Zimografía

3.6.3.2.3. Tinción activa

3.6.3.2.4. Papel filtro

3.6.3.3. Marcador proteico

3.6.3.3.1. 10-315 kDa

3.6.3.4. Método de Laemmli