1. Ventajas de cultivos celulares
1.1. Permiten un control preciso y fino del medio ambiente
1.1.1. Caracterización y homogeneidad de la muestra
1.1.1.1. Economía.
1.1.1.1.1. Motivaciones éticas.
2. Tipos de cultivos de tejidos.
2.1. Cultivo de órganos. Implica que la arquitectura característica del tejido “in vivo” se mantiene al menos en parte. P
2.1.1. Explantes primarios. Fragmentos de tejidos o de órganos que se adhieren a una superficie y en la que proliferan las células de la periferia del explante.
2.1.1.1. Cultivo celular. Supone una disgregación celular ya sea por medios enzimáticos o mecánicos.
3. Biología de la célula en cultivo.
3.1. solo formarán el cultivo aquellas células que sean capaces de superar el proceso de disgregación, y de adherirse al sustrato y proliferar en forma de monocapa o en suspensión.
3.1.1. Cuando se mantiene el cultivo se establece una nueva selección: aumentan en número aquellas células que tienen una mayor tasa de crecimiento.
3.1.1.1. El crecimiento de las células en cultivo primario prosigue a lo largo de una serie de generaciones o pases característicos de cada tipo celular y condiciones de cultivo.
3.1.1.1.1. un cultivo primario se mantiene durante más generaciones de las esperadas
3.1.1.1.2. Debido a la aparición en el cultivo de células inmortales.
3.1.1.1.3. Las celulas forman líneas estables o cultivos celulares permanentes.
4. Linea celular finita
4.1. Ploidía Diploide / Euploide
4.1.1. Transformación Normal
4.1.1.1. Dependencia de anclaje
4.1.1.2. Inhibición por contacto
4.1.1.3. Limitación de crecimiento por densidad
4.2. Mantenimiento Cíclico
4.3. Requerimientos de suero Elevados
4.4. Eficiencia de clonaje Baja
4.5. marcadores específicos
4.6. Funciones especializadas Se mantienen
4.7. Tasa de crecimiento Baja (24 a 96 h de replicacion
4.8. Rendimiento en cultivo Bajo (<106 células/mL; <105 células/cm2)
5. Las contaminaciones.
5.1. los tipos mas frecuentes
5.1.1. bacterias
5.1.1.1. para evitar es necesario
5.1.1.1.1. extremar las condiciones de esterilidad
5.1.1.1.2. realizar una serie de controles de esterilidad sobre las soluciones y recipientes a usar.
5.1.2. levaduras
5.1.3. micoplasmas
5.1.3.1. son células procariotas pequeñas (0,3 a 0,5 μm de diámetro)
5.1.3.2. responsables de las infecciones de los cultivos celulares proceden mayoritariamente de 4 especies: M.orale (humano), M.hyorhinis (cerdo), M.arginini (bovino) y A.laidlawii (bovino y también de roedores).
5.1.3.2.1. los requerimientos son complejos
5.1.3.3. grupos serológicos de micoplasmas de dos géneros (Mycoplasma y Acholeplasma).
5.1.3.3.1. sumergir el cubreobjetos en una placa de Petri con 3 mL de citrato sódico 0,6% y añadir lentamente 1 mL de agua.
5.1.3.4. No poseen pared celular y por ello sólo son capaces de crecer en ciertos medios.
5.1.4. virus
5.1.4.1. es un problema grave pues su prevención y eliminación es realmente difícil.
5.1.4.1.1. pueden tener un efecto citopático marcado,
5.1.4.1.2. o los más peligrosos son aquellos que crecen a baja tasa o en unas pocas células tan sólo.
5.1.4.1.3. La manera más eficaz de detectar la infección por virus es infectar un animal sensible y seguir la aparición de efectos citopáticos.
5.1.5. hongos
6. Técnicas de Contaje
6.1. Es necesario determinar la densidad de las células y el % viables
6.1.1. Cámara de contaje
6.1.1.1. Cámara de Neubauer
6.1.2. Equipos automáticos de contaje
6.1.2.1. Se basa en la medida de los cambios en la resistencia eléctrica que se producen cuando una partícula no conductora en suspensión en un electrolito atraviesa un pequeño orificio. Una pequeña abertura entre los electrodos es la zona sensible a través de la que pasan las partículas que se encuentran en suspensión. Cuando una partícula atraviesa el orificio desplaza su propio volumen de electrolito. El volumen desplazado es medido como un pulso de voltaje. La altura de cada pulso es proporcional al volumen de la partícula. Controlando la cantidad de la suspensión que circula a través del orificio es posible contar y medir el tamaño de las partículas.
6.2. Determinación de Vialidad
6.2.1. Tinción con azul de tripán
6.2.1.1. Es un coloide que se introduce en el interior de las células que presentan roturas en la membrana. Así pues las células que aparecen en la imagen de color azul, son consideradas no viables
7. El laboratorio de cultivo celular
7.1. La característica principal que define al laboratorio de cultivo celular es el mantenimiento de la asepsia.
7.1.1. el laboratorio de cultivo de tejidos general, para la manipulación de cultivos no patógenos se instalará preferentemente en una sala aislada y a la cual se le suministrará aire filtrado
7.1.2. el laboratorio de cultivo con patógenos supone un nivel de contención superior. A fin de evitar la salida accidental de éstos agentes se filtra el aire que sale de la sala
7.2. El área de trabajo para realizar cultivos debe instalarse en una parte del laboratorio tranquila, alejada de las vías de paso y a ser posible dedicada exclusivamente al cultivo de células.
7.3. Cabinas de flujo laminar Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes
7.3.1. Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina.
7.3.2. Protección personal: protección del personal de los posibles agentes dañinos del interior de la cabina.
7.3.3. Protección medioambiental: evitar la salida al medio ambiente de productos o agentes contaminantes.
7.4. Incubadores son equipos comunes en la mayor parte de laboratorios de biologá
7.4.1. Tomar en cuenta para determinar el tipo y número de incubadores requeridos
7.4.1.1. Tipo de cultivo a relizar: primarios o de líneas celulares estables
7.4.1.2. Especie y tipo de celulas a cultivar
7.4.1.2.1. Determinar la temperatura exacta de de incubación
7.4.2. Poco comunes
7.4.2.1. Incubador de CO2: mantenimineto de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada de CO2
7.4.2.1.1. Dispositivos de control de temperatura, con un termostato de seguridad que desconecta la función en caso de anomalía., ya que estabilidad de la temperatura es una característica esencial del incubador
7.4.2.1.2. Dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2, en la proporción deseada, entre el 4 y el 7%. El CO2 de elevada pureza se suministra en botellas presurizadas, y se mezcla en el dispositivo de inyección.
7.4.2.1.3. Dispositivo de control de la humedad ambiente.
7.4.2.1.4. Dispositivo de recircularización de aire. Es importante una recirculación del aire en el interior del incubador, a fin de homogeneizar la temperatura en su interior
7.4.2.2. Incubadores tipo "roller"
7.4.2.2.1. Se trata de un incubador o estufa, en el interior del cual se ha instalado un "rotor" de baja velocidad. Se utiliza para mantener cultivos en botellas cerradas (no requieren CO2).
7.5. instrumentos ópticos de observación: microscopio de contraste de fases invertido
7.5.1. El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio.
7.5.1.1. Caracteristicas
7.5.1.1.1. Microscopios de diseño original, en los cuales la fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un microscopio óptico convenciona
7.5.1.1.2. Condiciona el instrumento óptico es su ausencia de color, es decir se trata de muestras vivas y con poco contraste.
7.5.1.1.3. Captación de imágenes, fotográfico o de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.
7.6. Congeladores e instalación de criogenia
7.6.1. Recomendable que los congeladores y la instalación de criogenia estén en recintos separados a la unidad de cultivo propiamente dicha pues los ventiladores y compresores son una fuente importante de turbulencias y suciedad en el laboratorio.
7.6.2. Para el almacenamiento de soluciones y células a diferentes temperaturas
7.6.2.1. Neveras (4ºC) para el almacenamiento de medios, PBS, etc.
7.6.2.2. Congeladores de -20ºC para el almacenamiento de suero, aditivos y soluciones enzimáticas
7.6.2.3. congeladores de -80ºC para el almacenamiento a largo plazo de los aditivos del medio y de sustancias especialmente sensibles
7.6.2.4. Unidad de almacenamiento en nitrógeno líquido (-196ºC), para el almacenamiento de las líneas celulares.
7.7. Equipo de esterilización: autoclave y equipo de filtración
7.7.1. La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no sólo al medio en que se realiza el trabajo sino tqmbién a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios líquidos o sólidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su manipulación
7.7.1.1. Equipos de filtración
7.7.1.1.1. Estos equipos de filtración constan o bien de una fuente de vacío conectada a un kitasato dotado de una unidad de filtración esterilizada por autoclavado, o bien de una bomba peristáltica que fuerza el flujo de solución a través de una unidad de filtración hermética.
7.7.1.2. Autoclave
7.7.1.2.1. Instrumento que permite la esterilización por calor tanto de sólidos como de líquidos. La esterilización se realiza habitualmente a 121ºC, 1 atmósfera de sobrepresión durante un tiempo superior a 20 min.
7.7.1.2.2. Un autoclave de uso normal en el laboratorio de cultivo de tejidos suele disponer de temporizador y regulador de presión, y en algunos casos de un ciclo de secado para permitir secar el material sólido
7.8. Otros instrumentos
7.8.1. Además del equipo antes citado el laboratorio de cultivo de tejidos deberá estar equipado con otros instrumentos
7.8.1.1. Centrifugas
7.8.1.1.1. Es necesario disponer de una centrífuga refrigerada, con posibilidades de usar en ella desde tubos de pequeño volumen (1 a 2 mL) a botellas de gran capacidad (250 a 500 mL)
7.8.1.2. Contador electrónico de células ("cell counter").
7.8.1.2.1. Instrumento capaz de contar y medir partículas en suspensión.
7.8.1.3. Equipo de purificación de agua.
7.8.1.3.1. Es de gran importancia en la preparación de los medios, de los aditivos, o en cualquier solución que pueda estar en contacto con el cultivo, una absoluta esterilidad y ausencia de sustancias que puedan provocar alguna alteración al cultivo
7.8.1.4. Pipeteadores
7.8.1.4.1. Dispositivos o instrumentos para el trasvase o medición de fluidos.
7.8.1.4.2. Importante para mantener la asepsia y al mismo tiempo para la protección del operador
8. Medio de Cultivo
8.1. mediante
8.1.1. soluciones orgánicas complejas
8.1.2. Componentes purificados
8.2. Formado por
8.2.1. Naturaleza del sustrato
8.2.1.1. tipos:
8.2.1.1.1. Vidrio
8.2.1.1.2. Plástico desechable
8.2.1.1.3. Membranas plásticas porosas
8.2.1.1.4. Microsoportes
8.2.1.1.5. Superficies tratadas
8.2.1.1.6. Otros
8.2.1.2. Donde:
8.2.1.2.1. Líneas celulares crecen unidas en forma de monocapa
8.2.1.2.2. Se utilizan indicadores:
8.2.1.3. Material utilizado:
8.2.1.3.1. Placas petri (ventiladas, multiplacas, frascos Roux, roller bottless
8.2.2. condiciones:
8.2.2.1. Físicas/Químicas
8.2.2.1.1. pH de 7.4 (óptimo)
8.2.2.1.2. Osmolaridad de 260 a 320 mOsm/kg (óptimo)
8.2.2.1.3. Temperatura
8.2.2.1.4. Viscosidad
8.2.2.1.5. Tensión superficial
8.2.2.2. Fisiológicas (Composición del medio)
8.2.2.2.1. Formado por:
8.2.2.2.2. Medios empleados:
8.2.3. Composición de la fase gaseosa
8.2.3.1. Componentes significativos:
8.2.3.1.1. O2
8.2.3.1.2. CO2
8.2.4. Condiciones de incubación
9. Introducción a los cultivos celulares.
9.1. se desarrolló a partir de los últimos años del siglo XIX
9.1.1. Harrison es considerado el iniciador de los cultivos de tejidos animales, en 1907.
9.1.1.1. La primera limitación para el establecimiento de cultivos era lograr un medio nutritivo adecuado.
9.1.1.1.1. Burrows y Carrel realizaron los primeros intentos de establecer cultivos de células de mamífero, y consiguieron mantener explantes obtenidos a partir de perros, gatos y conejos de indias, así como en el crecimiento de tumores sólidos.
9.1.1.1.2. Los medios empleados fueron plasma suplementado con extractos de embrión.
10. Conceptos actuales de cultivo celular.
10.1. Actividad intracelular. Mecanismos implicados en los diferentes procesos intracelulares
10.1.1. Flujo intracelular. Movimientos intracelulares de sustancias y señales asociadas a los diferentes procesos fisiológicos
10.1.1.1. Ecología celular. Estudio de las condiciones ambientales responsables del mantenimiento de la funcionalidad celular, de su diferenciación
10.1.1.1.1. • Interacciones celulares. Procesos de inducción embrionaria, cooperación metabólica, inhibición por contacto o por adhesión, interacciones célula-célula.
11. Desventajas de cultivo celular
11.1. Técnica sensible.
11.1.1. Inestabilidad.
11.1.1.1. Validez del modelo “in vitro”.
12. Cultivo primario.
12.1. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano.
12.2. Si es de muchos tipos celulares pierde sus propiedades diferenciadas
12.2.1. entre ellas
12.2.1.1. Incapacidad de dividirse
12.2.1.1.1. debido a:
12.2.1.2. Conserva solo algunas propiedades que las caracterizan
12.2.1.2.1. debido a:
13. Línea primaria.
13.1. Cultivo establecido a partir de un tejido u órgano que se mantiene un periodo de tiempo limitado pero con reproducción de las células en el cultivo.
14. Línea celular continua.
14.1. Cultivo que se establece a partir de un tejido u órgano, en muchos casos de un tumor, y que se mantiene en cultivo un tiempo ilimitado. Se trata de células “inmortales”.
15. Métodos de disgregación de céluas en placa
15.1. Mecánicos
15.1.1. En cultivos celulares se emplean con frecuencia los métodos de rascado (“scrapping”) de la placa para arrancar las células adheridas
15.2. Químicos
15.2.1. Generalmente se trata de la adición de soluciones en las que no hay iones divalentes o bien de agentes quelantes de estos iones.
15.3. Enzimáticos
15.3.1. Tratamiento del tejido o del cultivo celular con soluciones de proteasas activas