1. RT-PCR
1.1. Quando é feito
1.1.1. Deve ser realizado no início da doença.
1.2. Aplicação
1.2.1. Aplicação: A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica presente, é porque o gene da mesma está sendo expresso e originando mRNA para tal proteína.
1.3. Como é realizado
1.3.1. Como é realizado: As amostras são coletadas através de swabs (cotonetes) de nasofaringe (nariz) e orofaringe (garganta).
1.4. Etapas
1.4.1. RT-PCR em uma etapa
1.4.1.1. Vantagens
1.4.1.1.1. - Rápido e com alto rendimento. - Menor risco de contaminação, devido a redução das etapas de pipetagem. - Redução da variação experimental, por ser realizado em um único tubo.
1.4.1.2. Desvantagens
1.4.1.2.1. - Menor precisão. - Menor sensibilidade devido a junção de duas etapas. - Detecção de uma menor quantidade de genes.
1.4.2. RT-PCR em duas etapas
1.4.2.1. Vantagens
1.4.2.1.1. - Detecta-se vários genes em uma mesma amostra de RNA. - Maior quantidade de primers de RT. Pode-se armazenar o cDNA para possíveis usos futuros. - Flexibilidade na preparação. - Permite múltiplos PCRs de uma única amostra de RNA / RT sem multiplexação.
1.4.2.2. Desvantagens
1.4.2.2.1. - Aumento do risco de contaminação do material, devido ao grande manuseio pelos passos de pipetagem e pela utilização de vários tubos. - Maior tempo consumido.
2. PCR Convencional
2.1. O que é
2.1.1. Consiste na replicação de sequências específicas de DNA utilizando equipamentos termocicladores.
2.2. Onde usar
2.2.1. A PCR tem muitas aplicações práticas e em pesquisa. Ela é rotineiramente usada em clonagens de DNA, diagnósticos médicos e análises forenses de DNA.
2.3. Objetivo
2.3.1. O propósito central da técnica de PCR é justamente ampliar uma área específica do DNA e desenvolver outras moléculas semelhantes somente com o uso de uma composição como cobaia. Essa amplificação é chamada assim porque as enzimas de restrição são as polimerases.
2.4. Etapas
2.4.1. 1ªEtapa: Desnaturação - O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
2.4.2. 2ºEtapa: Anelamento ou Hibridização - Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
2.4.3. 3ªEtapa: Extensão ou Polimerização - Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C.
3. Multiplex PCR
3.1. O que é
3.1.1. A reação em cadeia da polimerase multiplex refere-se ao uso da reação em cadeia da polimerase para amplificar várias seqüências de DNA diferentes simultaneamente. Esse processo amplifica o DNA em amostras usando vários iniciadores e uma polimerase de DNA mediada por temperatura em um termociclador.
3.2. Como é realizado
3.2.1. Mais de um segmento genômico é amplificado numa única reação, cada um com seu par de primers específico. Esta vantagem pode simplificar alguns experimentos, como a investigação de paternidade, onde vários marcadores genômicos devem ser analisados. Também é útil para a introdução de um controle de reação (a ser discutido posteriormente).
3.3. Para que serve
3.3.1. A função básica de um multiplexador é combinar múltiplas entradas num único terminal de dados. No lado da recepção um demultiplexador divide o fluxo único de dados nos sinais múltiplos originais.
3.4. Quando usar
3.4.1. A PCR multiplex é uma técnica que possibilita a detecção de várias seqüências de DNA alvo em uma única reação, apresentando vantagens como rapidez, especificidade e reprodutibilidade na detecção, contribuindo na identificação de focos primários de infecção por micobactérias de forma mais rápida.
4. Nested-PCR
4.1. O que é
4.1.1. Na nested PCR, ao invés de se usar uma amostra primária para fazer a PCR, utiliza-se o produto de uma PCR anterior com um par de primers internos ao par utilizado na primeira reação. Ou seja, é a PCR do produto da PCR.9
4.2. Quando usar
4.2.1. Essa variação da PCR é utilizada para aumentar a sensibilidade e especificidade nos casos em que as amostras utilizadas não são muito boas. Na prática, fazemos a primeira reação e, quando ela fica pronta, transferimos poucos microlitros para um outro tubo e fazemos a segunda reação (nested)
4.3. Como é realizado
4.3.1. Para melhorar a especificidade e a eficiência da reação, o segmento genômico é amplificado primeiro de forma abrangente, copiando até mesmo seqüências localizadas fora dela, e depois, utilizando este primeiro produto, a amplificação da real seqüência-alvo. Estas duas etapas (rounds) podem ser realizadas concomitantemente, ou em duas reações separadamente, caracterizando o Semi-Nested PCR.