Contagem de Enterobacteriaceae

1. 1. Fazer a higiene pessoal e vestir-se adequadamente

1.1. 1º Ao chegar no laboratório

2. 2. Fazer a limpeza da bancada com álcool 70%

3. 3. Organizar o material que será utilizado

4. 1. Pesar 25g da amostra num bécker com saqueta esterilizada dentro

4.1. 2º Pesagem das amostras na câmara de fluxo laminar

5. 2. Adicionar 225ml de diluente na amostra e homogeneizar

6. 1. Colocar 1ml da primeira diluição em três tubos (10-1, 10-2,10-3) para segunda diluição

6.1. 3º Diluição seriada

7. 1. Diluir o VRBG em água destilada e ferver no micro-ondas por 1 minuto. Resfriar a 45 graus e utilizar. OBS: não autoclavar!

7.1. 4º Preparação do ágar VRBG

8. 1. Das diluições seriadas, colocar 1ml de cada em placas de Petri em duplicata contendo ágar VRBG

8.1. 5º Plaqueamento em profundidade

9. 2. Homogeneizar em ''8 ou infinito'' e deixar solidificar.

10. 3. Colocar uma sobre camada de ágar em cima da camada solidificada e encubar as placas invertidas por 24h a 37 graus.

11. 1. Colônias típicas de Enterobacteriaceae no VRBG ficam com coloração rosa ou vermelho escuro e apresentam um alo mais claro em volta.

11.1. 6º Contagem de colônias

12. 2. Escolher 5 colônias típicas para realizar testes confirmatórios de Enterobacteriaceae e colocar para crescer em ágar nutriente a 37 graus por 24h.

13. 1. Avalia a presença da enzima citocromo oxidase. Pegar uma alçada da colônia crescida em ágar nutriente e passar para um disco de oxidase.

13.1. 7º Teste oxidase

14. 2. Fazer esfregaço e analisar: POSITIVO > desenvolvimento de coloração violeta/azul. NEGATIVO > fica na coloração amarelada.

15. 1. Inocular o meio de cultura com uma agulha de platina e colocar em dois tubos em meio glicose OF.

15.1. 8º Teste de fermentação de glicose

16. 2. Cobrir um dos tubos com óleo mineral para causar ambiente de anaerobiótico. Incubar a 37 graus por 24h.

17. 1. Após a incubação, se existir a presença de Enterobacteriaceae, ocorre a viragem do pH para ácidos em ambos tubos.

17.1. 9º Análise de resultados

18. 1. Exemplo: diluição 10^-2 apresentou placas com 112 e 126 colônias. 5 dessas colônias foram usadas nos testes de oxidase e fermentação de glicose e apenas 2 foram positivas para Enterobacteriaceae = 40% +.

18.1. 10º Cálculo

19. 2. Escolher placas que tenham entre 15 e 150 colônias.

20. 2. Resultado: 119 x 10^2 x 0,4 = 4,7 x 10^3 UFC/g.