1. Incompleta replicación, recomendado 1min/ kb
2. Tiempo y temperaturas de los ciclos
2.1. Pocos ciclos de PCR, produce menor amplificación
2.1.1. Realizar de 20 - 35 ciclos
2.2. Tiempo Corto
2.2.1. Extensión
2.2.2. Recalentado
2.2.2.1. Los cebadores no completaran la unión, recomendado 30 seg.
2.2.3. Desnaturalización
2.2.3.1. El ADN no se desnaturalizara degradarse , se recomienda para nicial 3 min y 30 seg. para desnaturalizar la plantilla
2.3. Tiempo Largo
2.3.1. Desnaturalización
2.3.1.1. El ADN podría degradarse, se recomienda para inicial 3 min a 95 °C y durante el ciclismo use 30 seg. a 95 °C.
2.4. Temperatura
2.4.1. Alta
2.4.1.1. Los ceadores no podran unirse, es recomedable la temperatura del recocido de 5 °C más baja Tm del cebador.
2.4.2. Baja
2.4.2.1. El ADN no se desnaturalizara por completo utilizar en desnaturalización 95°C .
3. Componentes de la PCR
3.1. Concentración
3.1.1. dNTP
3.1.1.1. Alta
3.1.1.1.1. Disminución de Mg++
3.1.1.2. Baja
3.1.1.2.1. los dNTP deben estar presente 200 μM
3.1.1.3. Impuros
3.1.1.3.1. Provocan incompleta o incorrecta amplificación o inhibición del proceso
3.1.2. Cebador
3.1.2.1. Alta
3.1.2.1.1. Union de manera ineficiente a la plantilla o entre sí
3.1.2.2. Baja
3.1.2.2.1. El recocido podría ser ineficaz
3.1.2.3. Impurezas
3.1.2.3.1. Inhibir la PCR
3.1.2.4. Mal diseñados o sintetizados
3.1.2.4.1. Amplificación de pseudogenes o cebar regiones indeseadas
3.1.3. >65%
3.1.3.1. Difícil de amplificar
3.1.3.1.1. Utilizar un gradiente térmico o desestabilizadores
3.1.4. Enzima
3.1.4.1. Baja
3.1.4.1.1. No todos los productos de PCR se replicaran.
3.1.5. G/C
3.1.6. Plantilla
3.1.6.1. Baja
3.1.6.1.1. Amplificación insuficiente
3.1.6.2. Degradada o contiene inhibidores
3.1.6.2.1. Utilizar plantilla nueva y incrementar ciclos. Probar adicionando un plásmido puro + plantilla.
3.1.6.3. No omitir
3.1.7. ADN template
3.1.7.1. Secuencias diana largas
3.1.7.1.1. Re optimizar el protocolo o aumentar los pasos, principalmente la extensión.
3.1.8. Agua impura
3.1.8.1. Utilizar agua sin nucleasas
3.1.9. Mg ++
3.1.9.1. Bajo
3.1.9.1.1. PCR reducido o nulo