1. Obtención de la muestra. La cirugía representa la mejor forma de obtener tejido humanos. El material empleado puede ser procedente de orígenes diferentes.
1.1. Biopsia. Se eplea para hacer un diagnóstico histopatológico y establecer un tratamiento.
1.1.1. Puede ser excicional cuando implica la extirpacion completa de un organo o un tumor.
1.1.2. Puede ser incisional. Se corta o se extirpa quirúrgicamente solo un trozo de tejido, masa o tumor. Se utiliza más a menudo en los tumores de tejidos blandos.
1.2. Diseccion. Es la division o seccion de un ser muerto para examinarlos y estudiar sus organos.
1.3. Necropsia. Se realiza para confirmar las causas de la defuncion en un hospital y la autopsia para averiguar las causas cuando fallecen de forma súbita y sin enfermedad aparente
1.4. Punción. Operacion quirurjica que consiste en abrir los tejidos de un instrumento punzante o haciendo una incision. Cuando se usa una aguja a un vaso sanguineo nos permite obtener una muestra de sangre.
1.5. Impronta. Procedimiento para estudios citológicos en los que los tejidos se frotan contra el cubreobjetos o el portaobjetos, para dejar las células aisladas sobre él y permitir su observación al microscopio.
1.6. Aspiración Procedimiento médico que se usa para extraer muestras de tejidos por succión.
1.7. Auopsia. Procedimiento médico que se emplea para obener informacion anatómica sobre la causa, naturaleza, extención y complicaciones de la enfermedad que sufrió en vida y permite formular un diagnóstico médico final.
2. Fijacion. Se utiliza para conseva los componenes de las celulas y tejidos con la menos brevedad posible con respecto al tejido vivp. Por ello debe efectuarse a la mayor brevedad posible para evitar la digestion del tejido por las enzimas contenidas en él (autolisis). Para conservar la estructura de manera opttima lo mejor es fijar el organismo todavia viviente inmediatamente despues de extrpar los tejidos.
2.1. Fisicos.
2.1.1. Frío.
2.1.2. Calor.
2.1.3. Congelación
2.1.4. Desecación.
2.1.5. Liofilización.
2.2. Bicloruro de Mercurio
3. Químicos.
3.1. Fijadores simples. Se emplea un solo reactivo.
3.1.1. Formaldehido al 10%.
3.1.2. Alcohol etilico de 96°
3.1.3. Metanol.
3.1.4. tetróxido de Osmio
3.2. Fijadores compuestos. Mezcla de algunos componentes simples.
3.2.1. Bouin
3.2.2. Zenker
3.2.3. Flemming
3.2.4. Helly
3.2.5. Heidenhain
4. Eliminación del fijador. Una vez fija la pieza, se lava perfectamente con agua corriente para eliminar el exceso del fijador y que no interfiera con los pasos subsecuentes de la técnica.
5. Obtención del corte. Para obtener cortes delgados y uniformes, es necesario que las piezas adquieran una determinada dureza y una estabilidad homogénea.
5.1. Cortes por congelación. Este procedimiento confiere a los tejidos un endurecimiento uniforme y permite realizar diagnósticos inmediatos de piezas operatorias y estudios histoquímicos, ya que la congelación no altera la composición química de los componentes histológicos del material a examinar. El microtomo de congelación realiza cortes de decenas de µm de grosor y consiste en una plataforma que se enfría a bajas temperaturas sobre la que se coloca la muestra.
5.2. Cortes por inclusion en parafina. se deposita el medio de inclusión en todos aquellos lugares en donde se encuentra el agua, o donde ésta ha sido extraída. Los medios o sustancias de inclusión pueden ser: Solubles en el agua: Como ser la “Celoidina, Gelatina, Plexiglas, o bien Insolubles en el agua: Como por ejemplo la parafina y otros
5.2.1. Deshidratación. El tejido se sumerge en una serie de diluciones de solventes orgánicos de concenraciones crecienes para exraer el agua, el más uilizado es el alcohol etilico.
5.2.2. Impregacion. Se realiza con algún solvente como puede ser el xileno, tolueno, benceno, cloroformo, etc.
5.2.3. Inclusion en parafina. Se realiza parq eu la muestra adquiera una determinada consistencia que le perita realizar con facilidad los cortes. Se lleva a cabo en dos pasos:
5.2.3.1. Inclusión preeliminar. Se sumergen las piezas en recipientes que contienen la parafina que se emplea con punto de fusion diferentes.
5.2.3.2. Inclusión definitiva. Una vez que la pieza de ha sumergido en la parafina con el punto de fusión más alto, se procede a formar un bloque que contenga en su interior la muestra
5.2.4. Obtencion de cortes. se obtienen secciones seriadas de tejido de espesor micrométrico que pueden ser empleadas posteriormente para su estudio al microscopio. Los micrótomos poseen cuchillas de metal y mecanismos para regular el grosor de los cortes y el avance de la muestra que se coloca en él
5.2.4.1. Indiferentes.- no son ni ácidos, ni básicos, no forman sales. Sudán negro.
5.2.4.2. Coloraciones progresivas.- cuando el tejido adquiere lenta, gradual o progresivamente, el grado de color necesario.
6. Coloración. La finalidad es resaltar el contraste natural de las estructuras y hacer mas evidentes los diversos componentes celulares y tisulares cambiando sus indices de refaccion, mediante el empleo de colorantes. Permite distinguir detalles estructuralmente invisibles o poco aparentes al microscopio por su capacidad de fijarse en ciertas partes de los tejidos.
6.1. Según su origen los coloranes se clasifican en naturales y artificiales.
6.1.1. Naturales .- aquellos que provienen de alguna fuente natural: Vegetal.- hematoxilina, orceína,safranina Animal.- carmín
6.1.2. Artificiales.- son producto de síntesis química. Derivados de la anilina
6.2. Por su comportamiento químico pueden ser:
6.2.1. Básicos o nucleares.- aquellos cuyo auxocromo tiene carga positiva y tiñen estructuras con carga negativa. Hematoxilina, azul de metileno, cristal violeta, azul de toluidina, fucsina básica, carmín.
6.2.2. Ácidos o citoplásmicos.- aquellos cuyo auxocromo tiene carga negativa y tiñen estructuras con carga positiva. Eosina, safranina, azul de anilina, carmín de índigo, fucsina ácida, orange G.
6.2.3. Neutros.- tienen cromógenos con cargas positivas y negativas. Wright, Giemsa. Mezclas de ácidos y básicos, se usan en Hematología.
6.3. Clasificación de colorantes:
6.3.1. Coloraciones generales: se basan en el teñido intenso de los núcleos y débil del citoplasma o en la fuerte coloración de ambas partes.
6.3.2. Coloraciones directas.- aquellas que se producen simplemente por inmersión en el colorante ya que hay afinidad entre la estructura y el colorante.
6.3.3. Coloraciones indirectas.- aquellas en las que es necesario que el objeto a colorear sea tratado previamente con un mordente, que lo prepara para recibir el colorante, ya que no hay afinidad entre éste y la estructura.
6.3.4. Coloraciones regresivas.- aquellas en las que el objeto sobrecoloreado, por la excesiva concentración del colorante, debe sufrir una diferenciación, es decir la acción de un disolvente para quitar el excedente.
6.3.5. Coloraciones ortocromáticas.- aquellas en las que la estructura toma el color del colorante.
6.3.6. Coloraciones metacromáticas.- las estructuras viran el color del colorante a un tono diferente.