1. Modalidades de la técnica de PCR
1.1. PCR in situ
1.1.1. No requiere extracción del ADN del tejido.
1.2. PCR convencional
1.2.1. detección del producto de amplificación mediante una electroforesis en gel de agarosa o acrilamida.
1.3. PCR cualitativa
1.3.1. permite detectar la presencia o ausencia de un fragmento de ADN determinado.
1.4. PCR múltiple
1.4.1. se realiza la amplificación de más de un fragmento de ADN en una sola reacción de PCR
1.5. PCR semicuantitativa
1.5.1. ermite conocer los niveles de expresión de un gen (ARNm) en particular, y normaliza los niveles encontrados de este gen con los encontrados en un gen de expresión constitutiva
1.6. PCR cuantitativa
1.6.1. el producto de PCR es cuantificable, lo que permite reportar en números absolutos la cantidad de un microorganismo o del ARNm de un gen en una muestra.
1.7. PCR selectiva
1.7.1. primers capaces de hibridar solamente en secuencias con presencia de una mutación, por lo que, en caso de estar ausente, no se produce un producto de PCR.
1.8. PCR en tiempo real
1.8.1. La detección de las copias del producto de PCR se realiza al mismo tiempo que sucede la amplificación, mediante intercalados en el producto de PCR
1.9. PCR anidada
1.9.1. amplifica las secuencias de ADN en dos rondas de amplificación con distintos pares de iniciadores o primeros en cada una.
1.10. PCR en punto final
1.10.1. el producto de PCR se analiza después de 25 a 35 ciclos en el punto previo a la saturación de la reacción, mediante un gel de electroforesis.
2. Desoxinucleótidos
2.1. Proporcionar el grupo fosfato con el que se formará el enlace fosfodiéster en la unión nucleótido- nucleótido.
3. Iniciadores
3.1. Proporcionar un extremo 3’ libre al que se han de añadir los nucleótidos consecutivos mediante enlace fosfodiéste
3.1.1. Antisenido
3.1.1.1. Originará la cadena 3’-5’
3.1.1.2. Es complementario y antiparalelo a la cadena 5’-3’
3.2. Se utilizan para reconocer por complementariedad secuencias blanco en el ADN molde.
3.3. Cloruro de magnesio
3.3.1. Actúa como cofactor de la ADN polimerasa
4. DNA POLIMERAZA
4.1. La longitud del producto duplicado la determinan los primers/oligonucleotidos
5. Necesidad de obtener un gran número de copias de fragmentos específicos de ADN de manera rápida y económica
5.1. Pasos PCR
5.1.1. 2. Pasos de amplificación
5.1.1.1. Almacenamiento temporal
5.1.1.2. Desnaturalización
5.1.1.3. Alineación
5.1.2. 1. Inicio de la desnaturalización
5.1.2.1. Temperatura de 95°C
5.1.2.2. Extension
6. Se basa en
6.1. Se basa en una replicación exponencial in vitro de una molécula de ADN genómico (ADNg) o ADN complementario (ADNc)
6.2. La longitud del producto duplicado la determinan los primers/oligonucleotidos
6.3. Se basa en una secuencia que le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la cadena antiparalela
6.4. Se basa en una secuencia que le sirve de molde y, por complementariedad, sintetiza la cadena antiparalela
7. Amortiguador
7.1. Proporciona el pH y concentraciones de sales adecuadas para la correcta función de la ADN polimerasa.
8. DNA molde
8.1. Retrotranscripción
8.1.1. Permite convertir el ARN en ADNc