1. Grandiente de densidade
1.1. Permite a separação dos espermatozóides,através da massa relacionada a quantidade de DNA e proteína nuclear existente,sendo obtido maior valor em espermatozóides portadores do cromossomo ¨X¨.
1.1.1. A separação irá ocorrer devido a diferença do conteúdo de DNA dos espermatozóides x e y, que resulta em uma diferença de densidade,sendo possível executar a técnica utilizando um gradiente com alta resolução de densidade como o Percoll®.
1.1.2. Descrição da técnica
1.1.2.1. As três camadas dos gradientes de densidade contínuos de Percoll e OptiPrep são consecutivamente montadas em tubos de 15 ml de poliestireno e os tubos permanecem a 4 °C por 24 h para transformação do gradiente descontínuo em um gradiente contínuo de densidade.
1.1.2.1.1. Para a centrifugação, aproximadamente 100 milhões de espermatozoides recém-colhidos (sêmen fresco) são depositados sobre cada tubo contendo os gradientes contínuos de Percoll e OptiPrep, centrifugados a 500 x g por 15 min. a 22 °C, removidos os sobrenadantes e colhidos os espermatozoides, localizados no fundo dos tubos.
1.1.2.1.2. Vantagens:
1.1.2.1.3. Desvantagens:
1.1.2.1.4. -Precisão de somente 70% -Impossibilidade de armazenamento do gradiente -Dificuldade para preparar diversas camadas -Proporção baixa de espermatozóides recuperados.
2. Citometria de Fluxo
2.1. Consiste na emissão de raios laser, coloração diferencial dos espermatozoides e as forças hidrodinâmicas que os direcionam durante a separação. A sexagem dos espermatozóides no citômetro de fluxo baseia-se na intensidade de fluorescência após a adição de um corante florescente e permite a separação de 100 células/segundo.
2.1.1. Descrição da técnica
2.1.1.1. O ejaculado é diluído para 200 x 106 espermatozoides/ml em meio Tris suplementado com o corante fluorescente,incubado durante 45 min a 35ºC
2.1.1.2. Após a coloração, as amostras são diluídas na proporção de 1:1 em meio Tris suplementado com 4% de gema de ovo e 0,0015% de corante alimentar e filtrado através de um filtro de 50 μm para remover detritos ou células aglutinadas antes da triagem.
2.1.1.3. As amostras são submetidas a um classificador de células de alta velocidade operado a 40 psi com laser pulsado de diodo sólido a 125 mW com fluído da bainha.
2.1.1.4. As comportas são ajustadas para atingir 90% de pureza e os espermatozoides sexados são classificados em meio Tris. Depois de serem refrigerados a 4°C por 90 min., os espermatozoides sexados são centrifugados e diluídos em Bioxcell para alcançar a concentração de 2x106 de espermatozoides
2.1.1.5. Por fim, o sêmen é envasado em palhetas de 0,25 ml e congelados.
2.1.1.5.1. Vantagens:
2.1.1.5.2. Desvantagens:
3. Nanopartículas Magnéticas
3.1. Baseia-se na diferença de cargas entre as membranas espermáticas, utilizando nano-partículas magnéticas com carga suficiente para atrair apenas as células contendo o cromossomo ¨Y¨. Espermatozoides femininos possuem carga elétrica de -20 milivolts (Mv), enquanto os masculinos carregam carga de -16 Mv.
3.1.1. Descrição da técnica:
3.1.1.1. São utilizadas Nanopartículas a base de magnetita,revestidas com sílica (diâmetro 50nm), as nanopartículas formaram uma suspensão.
3.1.1.1.1. Homogeneização da suspenção de NPs
3.1.1.1.2. Adicionar na suspenção de nanoparticulas a solução espermática (3:1) e incubar durante 4 min.
3.1.1.1.3. Parede do tubo é colocada em contato com imã por 20 min (imã é composto por três zonas circulares magnéticas contidas numa estrutura de acrílico.)
3.1.1.1.4. Os espermatozoides "Y" têm uma carga positiva no nível da membrana são atraídos para essas esferas negativas e depois para as 3 zonas circulares magnéticas.
3.1.1.1.5. Espermatozóides X são mantidos em suspensão sem aderir a essas áreas na parede do tubo.
3.1.1.1.6. Após 20 minutos se coleta o esperma "Y" e se esvazia a solução do tubo, mesmo em suspensão, em um novo tubo de 15 ml.