1. Electroforesis en gel en presencia de hidróxido de metil mercurio.
1.1. Las muestras de ácido nucléico son separadas por electroforesis horizontal en gel de agarosa
2. Preparación de muestra de RNA de células y tejidos de Drosophila melanogaster
2.1. La extracción de ARN realizó bajo el protocolo presentado por Alwine et al (1977) utilizando las células y tejidos previamente extraídos en solución. La suspensión puede contener DNA pero en una fracción mejor.
3. Extracción de células y tejidos para la preparaciones de RNA
3.1. Se utilizaron glándulas salivarias de larvas en la fase tardía de larvas de D.melanogaster utilizando el protocolo modificado de Zweidler y Cohen (1971).
3.1.1. Los embrione fueron descorionizado y homogenizados con cloruro de sodio en solución.
3.2. El RNA de la línea celular Eschalier`s Kco fue marcada con 32P-ortofosfato según el protocolo de Rubin & Hogness(1975)
4. Preparación del gel para transferencia
4.1. Se deben eliminar ruidos de agentes como el hidróxido de metil mercurio que reaccionan con las bases nitrogenadas de los ácidos nucléicos. También se debe eliminar el 2-mercaptoetanol y el iodoacetato
4.2. Se debe provee un ambiente iónico apropiado para la transferencia a través de lavados con buffer de borato.
5. Hibridización con una sonda radioactiva específica
5.1. Sondas DNA plasmídico marcado con 32P fue hibrizado con RNA en el papel de acuerdo con el procedimiento de Denhardt (1966)
6. Conclusiones
6.1. La detección de moléculas específicas de RNA es más rápida y sensible con este método de gel-técnica de trasferencia hibridación
6.2. El papel DBM es fácil de usar y puede ser reusado con otra sonda después de ser lavado con 99% formamida a 65º para remover la primera sonda
6.3. Si se realiza el tratamiento del gel de hidrílisis alcalina el tamaño del RNA puede ocasionar diferente eficiencia en la transferencia.
6.4. El procedimiento puede se aplicado para la detección de distintas especies de RNA con una sonda apropiada
6.5. Este procedimiento es útil en la detección de pequeñas cantidades de RNA específico dentro de unamezcla compleja de distintas especies no relacionadas
6.6. Este método permite medir el largo del RNA, sólo una porción del RNA necesita ser complementario a la sonda (otros procedimiento mide el largo de la región )
6.7. Pequeñas moléculas desnaturalizadas de DNA(menor a 100 bases) puede ser fácilmente trasnferidas del gel al papel DBM acoplado
7. Se busca transferir bandas de RNA provenientes de gel de agarosa a papel tratado con el objeto de mejorar la sensibilidad y disminuir el ruido de la muestra
8. Síntesis del papel diazobenciloximetilo (DBM)
8.1. 1. Síntesis de 1{(m-nitrobenciloxi) metil] piridinio Cloruro (NBPC).
8.1.1. Solución de: HCl seco + paraformaldehido + m-nitrobencil alcohol+ benzeno (Agitación por 2 hrs a temperatura ambiente).
8.1.2. Remover fase orgánica y secar con Na2S04. Remover benceno con reducción de presión
8.1.3. Destilar remanente con reducción de presión y ebullición entre 150-154ºC a 1.5 mmHg.
8.1.4. Añadir piridina helada con agitación y sal de piridinio para cristalizar
8.1.5. Se realizan lavados con piridina, éter de petróleo y secar a presión reducida
8.2. Preparación de papel Aminobenciloximetil( papel ABM)
8.2.1. Se empapó una hoja filtro Watman 540 Solución acuosa de NBPC con acetato de sodio. La hoja fue secada y calentada para posteriormente ser lavada y secada.
8.2.2. El papel nitrobenciloximetilo fue reducido a papel ABM usando ditionito de sodio 20%. Posteriormente es secado y lavado con 30% de ácido acético y agua. Finalmente se seca a condiciones 4ºC con desecador
8.3. Diazotización de papel ABM
8.3.1. Se convierte el papel ABM a papel DBM con un tratamiento de agua + Hcl+ NaNO2 por 30 min a 4ºC. Posteriormente el papel se lava con agua fría y un buffer de borato de sodio.
8.3.2. Cada papel es capaz de acoplar 16-24 ug de ácido nucleico monocatenario por cm2 de superficie.
9. Híbrido de DNA plásmidico
9.1. El plásmido híbrido cDm 103 (una unidad de repetición de 17,000 pares de bases de D. melanogaster ADNr insertado en el plásmido ColE1
9.2. El plásmido híbrido pkdm 34-H.9 contenía secuencias homólogas a RNA de D. melanogaster 14s mitocondrial
9.3. Se construyó el plásmido híbrido insertando un segmento duplex de cDNA en el sitio Bam HI del plásmido pSC105 .
9.3.1. El plásmido fue propagado por el vector -huesped EK1