1. Electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE)
1.1. Productos intactos de PCR de individuos afectos y sanos se someten a electroforesis con agente desnaturalizante de DNA
1.1.1. Cambio en nucleótido de DNA cambia punto donde comienza a desnaturalizarse
1.1.2. Migración al separarse hebras de DNA se retarda
2. Análisis heterodúplex
2.1. Molécula de DNA con 1 o más pares de nucleótidos desapareados
2.2. Desapareamiento retarda movilidad electroforética
2.3. Combinación de muestras de ADN de paciente y control
2.3.1. Si hay diferencia en secuencia se forma heterodúplex
3. Micromatrices de oligonucleótidos
3.1. Microarrays para análisis de >100mil biomoléculas en volúmenes de reacción pequeños
3.1.1. Detección de mutaciones
3.1.2. Amplificación y marcaje de DNA de pacientes con fluorescencia utilizando PCR
3.1.2.1. Fluorescencia en posición determinada indica unión de DNA con oligonucleótidos
4. Cromatografía líquida desnaturalizante de alto rendimiento (DHPLC)
4.1. Detección de mutaciones en un solo o poco nucleótidos
4.2. Separación de fragmentos de DNA según tamaño o presencia de heterodúplex
4.3. Migración de fragmentos de DNA normal y mutante
4.3.1. DNA heterodúplex fluye antes en la columna
5. Sistema de minigenes
5.1. Construir en vector plasmídico parte de un gen con algunos de sus exones e intrones
5.2. RNA de cultivos celulares es extraído y analizado por RT-PCR
5.2.1. Comparación de patrones de splicing resultantes de minigén con secuencia normal con la de minigen portador
5.2.2. Detección de mutación a nivel de procesamiento de pre-RNA mensajero
6. Análisis mediante RFLP
6.1. Cambio puntual por mutación genera o destruye diana de reconocimiento de enzima de restricción específica
6.1.1. PCR y digestión con enzima de corte específica
6.1.2. Separación de fragmentos de corte
6.1.3. Permite análisis sin necesidad de secuenciar DNA
7. AGUIRRE SCHUETTE MANUEL GILBERTO CÓDIGO: 217797697 BIOLOGÍA MOLECULAR EN LA CLÍNICA E10
8. DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE MUTACIONES EN RNA
9. SECUENCIACIÓN DE DNA
9.1. Determinación de orden exacto de nucleótidos en segmento de ADN
9.1.1. Método de Sanger el más utilizado
9.1.2. Cebadores, DNA polimerasa, dNTPS
9.1.3. ddNTPs terminadores de síntesis
9.1.4. Detector de fluorescencia traduce la secuencia
9.1.5. Comparación de secuencia de paciente con secuencia normal
10. Análisis de conformación de cadenas sencillas de DNA (SSCP)
10.1. Detección de mutaciones
10.1.1. Amplificación de PCR de exones e intrones flanqueantes
10.1.2. Desnaturalización y electroforesis
10.1.3. Cadena de DNA sencilla asume conformación tridimensional dependiendo de su secuencia
10.1.4. Diferentes conformaciones migran a diferente velocidad
10.1.4.1. Dos bandas por fragmento amplificado
11. Análisis por rotura química de bases desapareadas
11.1. Amplificación de muestras de DNA de paciente y control
11.2. Marcado de una muestra con fluorescencia o radioactividad
11.3. Diferencias en secuencias forman heterodúplex
11.4. División de muestras en dos alicuotas
11.4.1. Tratada con Hidroxilamina
11.4.1.1. Modifica citocinas no apareadas
11.4.2. Tratada con Tetraóxido de osmio
11.4.2.1. Modifica timinas no apareadas
11.5. Tratamiento posterior de ambas con piperidina
11.5.1. Rome residuos modificados
11.6. Electroforesis de DNA
11.6.1. Si hay rotura de DNA aparecen 2 fragmentos
12. PCR
12.1. Amplificar distintas partes de genes
12.2. Cebadores, Taq polimerasa
12.3. Desoxirribonucleótidos trifosfatados
12.4. Desnaturalización, apareamiento y extensión
12.5. Repetición 35-40 veces
13. Transcripción inversa seguida de amplificación por PCR (RT-PCR)
13.1. Distinguir alteraciones en procesamiento de RNA
13.1.1. Transcripción inversa
13.1.1.1. mRNA molde para síntesis de hebra de DNA complementario (cDNA)
13.1.2. PCR
13.1.2.1. Usa cDNA como molde para PCR convencional