REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

1. Quais são as etapas do PCR convencional?

1.1. Desnaturação

1.2. Anelamento

1.3. Extensão

2. Inserindo sítios de enzimas de restrição nos primers

2.1. Tecnologia do DNA recombinante l

2.2. Inserir o inserto amplificado sob um vetor

2.3. Utilização de endonucleases de restrição que cortam o DNA em regiões específicas e palidrones

2.4. Buscar enzimas em Neb Cutter

3. Como utilizar enzimas de restrição?

3.1. Usar a mesma enzima nos primers sense e anti-sense, pode levar à perda do rendimento da clonagem

3.2. O uso de enzimas diferente garante que o inserto entrará na orientação certa

4. RT-PCR

4.1. Pcr utilizando transcrição reversa

4.2. Analisa amostras que possuem RNA

4.3. É preciso produzir DNA a partir do RNA

4.4. Possui análises de transcrição genica e caracterização dos transcritos

4.5. A análise do resultado é feita por eletroforese em gel de agarose

4.6. Antecede a reação do PCR, mas todo o processo pode ser feito em uma ou duas etapas

5. PCR em tempo real ou PCR quantitativa-qPCR

5.1. Detecta pequenas quantidades de ávidos nucleico

5.2. Análise de expressão genica

5.3. Detecção de vírus e bactérias

5.4. Quantificar vírus e bactérias (carga viral e carga bacteriana)

5.5. Determina estágios de câncer

5.6. Genotipagem

6. Em que se baseia?

6.1. Processo de replicação do DNA que sua função é formar uma nova molécula a partir de uma pré-existente

6.2. A PCR é um processo de utiliza apenas o DNA polimerase de organismos termófilos

7. Quais são os reagentes?

7.1. Amostra de DNA

7.2. Primers

7.3. dNTPs

7.4. Mg2+

7.5. Taq DNApolimerase

7.6. Tampão

8. Nucleotídeo de adenina,tiamina, citosina e guanina para que elas possam ser incorporadas em uma nova fita de DNA

9. Dicas para um bom primer:

9.1. Tamanho: 18 a 24pb

9.2. Tm(temperatura de melting)= 55 a 65graus C)

9.3. Concentração de GC= de 40-60%

9.4. Formação de grampos e dimeros

9.5. Site OligoAnalyzer