1. PCR: É uma técnica alternativa à clonagem para gerar uma quantidade ilimitada de uma sequência do DNA, através da amplificação enzimática.
1.1. Técnica possui especificidade e é sensível (requer menor amostras do paciente quando comparada a outros métodos de análise de ácido nucleico). É mais rápida e mais barata. Tem como objetivo amplificar sequência alvo do DNA.
1.2. É uma alternativa à clonagem para gerar quantidade ilimitada de determinada sequência;
1.3. Primers são projetados de modo que um é complementar para cada lado da dupla hélice do DNA;
1.3.1. Ocorre a alternância de temperaturas a cada ciclo no termociclador. O ciclo é composto por 3 fases: Desnaturação, anelamento e polimerização.
1.3.2. Desnaturação: Abertura da dupla fita de DNA (rompimento das pontes de hidrogênio). Anelamento: Pedaços de primer (DNA) se anelam. Polimerização: Considerada temperatura ótima, TAQ DNA polimerase encontra o primer, lê fita mãe e polimeriza a fita filha.
1.3.3. A cada ciclo realizado, aumenta exponencialmente o número da sequência alvo;
1.3.4. Após sucessivos ciclos e amplificação da sequência desejada, realiza-se a eletroforese.
1.3.4.1. Eletroforese: Verificar se a técnica de PCR funcionou através da separação de moléculas por densidade e cargas distintas. É realizado para obter o diagnóstico de doenças e verificação da expressão de proteínas. A eletroforese é um procedimento simples e de baixo custo.
1.3.4.1.1. Para a realização da técnica é utilizado gel de agarose, solução tampão, cuba de eletroforese, marcador de peso molecular e uma substância (brometo de etídio) capaz de permitir a visualização das amostras quando expostas à luz UV.
1.3.4.1.2. Os nucleotídeos possuem caráter negativo. O DNA apresenta carga negativa, sendo assim, o gene amplificado, se torna mais pesado e com carga mais negativa, fazendo com que apresente maior velocidade de escoamento no ágar ("corre mais"), no sentido do polo positivo para o polo negativo.
2. Sequenciamento de Sanger
2.1. DNTP => Adição de Nucleotídeos => Alongamento do DNA => ligação fosfodiéster com o próximo nucleotídeo
2.2. DDA, DDT, DDC, DDG Não possuem 3’OH Impedem que a DNA polimerase se ligue à próxima base complementar ao molde que será sequenciado
3. Clonagem molecular
3.1. Digestão: Quebra do plasmídeo e do vetor => Inserção da enzima de restrição => sítios de reconhecimento para clivagem (regiões palindrômicas)
3.2. Clivagem no eixo de simetria: Moléculas com extremidades abruptas
3.3. Clivagem simetricamente situada ao redor do eixo de simetria: moléculas com extremidades coesivas
3.4. Ligação: A quebra coesiva é mais fácil de propiciar a ligação => necessário alta quantidade de vetor, e DNA ligase => Garantir que haverá a formaçào do DNA recombinante => Nada impede que o plasmídeo volte a fechar
3.5. Transformação: Eletroporação => Choque de 2 segundos - separaçào da membrana => Choque térmico à 100 º e depois depósito no gelo
4. A biologia molecular investiga interações entre diversos sistemas celulares, incluindo relações entre DNA, RNA e síntese proteica.
5. RT-PCR: A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em tempo real é uma técnica de Biologia Molecular que permite replicação in vitro do DNA de forma extremamente rápida
5.1. Quando a sequência que deseja amplificar é de RNA, utiliza-se este método para realizar a transcrição reversa de RNA em cDNA através da enzima TRANSCRIPTASE REVERSA, pois a DNA - Polimerase não utiliza o RNA como template.
5.2. Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente com o PCR.
5.3. O sistema TaqMan utiliza uma sonda fluorescente para possibilitar a detecção de um produto específico da PCR conforme esse se acumula durante os ciclos da reação. Assim, a cada nova fita sintetizada, aumenta a intensidade da emissão fluorescente.
5.4. Dispensa a realização da eletroforese, pois um aparelho semelhante ao termociclador ligado a um computador permite a leitura em tempo real do resultado do PCR.
6. Polimorfismo x Mutação
6.1. Variações nas sequências de DNA que ocorrem na população geral de forma comum. Quando ocorre em pelo menos 1% da população.
6.2. Não causa doença letal
6.3. Podem causar doenças multifatoriais
6.4. Mutações pontuais: substituição ou inserção/deleção
6.5. Macro-rearranjos: Translocações, inversões, deleções.
6.6. SNP: 2/3 corresponde a substituição de C por T. 90% de todas as variações genômicas. Se < 1% da população -> mutação.
6.7. VTNR: Microssatélites => Polimorfismo de repetições curtas. Transmissível aos descendentes. Excelentes marcadores genéticos => altamente reprodutível.
7. CRISPR - CAS9
7.1. Terapia gênica: Transferência de material genético novo para as células resultando em benefício terapêutico (Vacinas, antibióticos, anestesia).
7.1.1. Imunidade bacteriana