1. Quimiolusminescência
1.1. definição
1.1.1. produção de luz a partir de uma reação química
1.2. utilização
1.2.1. detecção de hormônios
2. ELISA
2.1. definição
2.1.1. utilizado para detectar ag ou ac
2.1.1.1. baseia-se na imobilização de um dos componentes (ag ou ac) em fase sólida e na utilização de um conjugado (ag ou ac) ligado a uma enzima que atua no substrato formando um produto colorido que é monitorado por meio de um espectofotômetro
2.2. etapas
2.2.1. 1. sensibilização da placa de ELISA (poliestireno) com ag 2. bloqueio (leite desnatado, caseína) -> bloquear os sítios reativos remanescentes 3. lavagens 4. adição da amostra a ser testada 5. adição do conjugado marcado com enzima (peroxidase/fosfatase alcalina) 6. adição do substrato (H2O2) + cromógenos (OPD, TBM) 7. solução de paragem (H2SO4) e leitura (visual ou espectofotométrica)
2.3. tipos
2.3.1. direto
2.3.1.1. detecção de antígeno
2.3.1.1.1. o antígeno aderido à palca é detectado por um anticorpo diretamente conjugado a uma enzima
2.3.2. indireto
2.3.2.1. detecção de anticorpo
2.3.2.1.1. o antígeno aderido à placa é detectado em dois estágios (placa sensibilizada com ag)
2.3.3. sanduíche/captura
2.3.3.1. placa sensibilizada com anticorpo para detectar antígeno ou anticorpo
2.3.3.1.1. o ac ou ag do paciente fica entre dois anticorpos
2.3.3.1.2. como funciona
2.3.4. captura de competição
2.3.4.1. como funciona
2.3.4.1.1. 1. placa sensibilizada com anticorpos específicos 2. adiciona amostra do paciente (ligação antígeno-anticorpo) 3. a depender a quantidade de ag na amostra do paciente, alguns sítios de ac ficam livres (não tinha ag suficiente) 4. adiciona o antígeno laboratorial conjugado com a enzima - se liga nos sítios que não houve ligação
2.3.4.2. ag/ac competem pelo conjugado
2.3.5. streptavidina/biotina
2.3.5.1. forma de amplificar o sinal de detecção
3. Imunocromatografia
3.1. características
3.1.1. simples e de baixo custo, resultado rápido, baixo volume de amostra
3.1.2. são os testes rápidos (qualitativo)
3.1.3. teste de triagem, rápido, econômico
3.2. capaz de detectar a presença de uma determinar substância-alvo
3.2.1. pátogenos (vírus, bactérias e parasitas)
3.2.2. biomarcadores
3.3. amostras
3.3.1. soro sangue urina
3.4. exemplo
3.4.1. testes de gravidez teste da COVID-19
3.5. princípio
3.5.1. composto por uma membrana de nitrocelulose, nanopartículas coloridas e anticorpos
3.5.1.1. 1. amostra é adicionada no filtro de amostra (absorção e filtragem) 2. flui através através do teste por capilaridade 3. passa pelo suporte do conjugado (interação antígeno-anticorpo) 4. região de controle (C) 5. na região T (teste) contém a membrana de nitrocelulose, onde os regaentes podem se ligar à substância-alvo na linha teste
3.5.1.1.1. para detectar antígeno, emprega-se um anticorpo de captura, ligado à matriz e um anticorpo marcado com partículas coloridas que é específico para o antígeno pesquisado
3.5.1.1.2. para detectar anticorpo, utiliza-se um antígeno específico ligado à matriz e um anticorpo antiimunoglobulina marcado com partículas coloridas
3.6. resultados
3.6.1. reagente: T e C não reagente: C
3.7. tipos
3.7.1. diagnóstico direto
3.7.1.1. detecta agente etiológico (vírus, bactérias e parasitas)
3.7.2. diagnóstico indireto
3.7.2.1. anticorpos específicos
3.7.3. testes múltiplos
3.7.3.1. antígenos + anticorpos
4. Nefelometria e Turbidrimetria
4.1. são imunoensaios de precipitação
4.1.1. medição de partículas suspensas numa solução (turbidez)
4.1.1.1. a luz incidente estará sujeita a 3 reações
4.1.1.1.1. 1. parte será absorvida 2. parte será transmitida 3. parte será dispersa em várias direções
4.2. nefelometria
4.2.1. aparelho utilizado
4.2.1.1. nefelômetro
4.2.1.1.1. fonte de luz branca
4.2.1.1.2. ou infravermelha
4.2.2. detetcção da luz dispersa em ângulos de 45º e 90º em relação à luz incidentes
4.2.3. maior sensibilidade e precisão
4.3. turbidimetria
4.3.1. aparelho utilizado
4.3.1.1. turbidímetro
4.3.2. detecção da luz transmitida
4.3.2.1. pode medir a absorbância
4.4. aplicação
4.4.1. dosagem de imunoglobulinas
4.4.2. dosagem de proteínas séricas
4.5. importante
4.5.1. a intensidade de luz emitida e captada varia de acordo com o número, tamanho e forma das partículas da amostra
5. Imunoensaios
5.1. definição
5.1.1. técnicas utilizadas na detecção e/ou quantificação de antígenos ou anticorpos ou outras substâncias que desempenham papel de antígeno no ensaio
5.2. tipos
5.2.1. imunoensaios de aglutinação
5.2.1.1. aglutinação direta e indireta
5.2.2. imunoensaios de precipitação
5.2.2.1. nefelometria e turbidimetria
5.2.3. imunoensaios líticos
5.2.3.1. reação de fíxação de complemento
5.2.3.2. inibição da hemólise
5.2.4. imunoensaios utilizando conjugados
5.2.4.1. imunocromatografia
5.2.4.2. imunofluorescência
5.2.4.3. ELISA
5.2.4.4. quimioluminescência
5.2.4.5. imunoblot
5.2.4.6. citometria de fluxo
6. Imunonfluorescência
6.1. definição
6.1.1. empregados conjugados constituídos de ac ou ag ligados covalentemente a fluorocromos
6.1.1.1. fluorocromos são moléculas que absorvem luz em comprimento de onda baixo e elevada energia e emitem luz em comprimento de onda maior, de menor energia, fenômeno conhecido como fluorescência
6.2. reagentes utilizados
6.2.1. 1. anticorpos marcados
6.2.2. 2. antígenos ou amostras fixados à lâmina de microscopia
6.2.3. 3. uso de glicerina alcalina, cujo ph de 8,5 determina a máxima intensidade na emissão de fluorescência
6.3. tipos
6.3.1. direta
6.3.1.1. detecção do antígeno diretamente na amostra utilizando anticorpo antígeno-específico marcado com substância fluorescente
6.3.1.2. utilizada para a pesquia de vírus respiratórios (influenza, para-influenza, vírus sincicial respiratório e adenovírus)
6.3.2. indireta
6.3.2.1. detecção de anticorpos utilizando um anticorpo antiimunoglobulina humana
6.3.2.1.1. 1. amostra sensibilizada com antígeno 2. adição de anticorpos 3. ligação antígeno-anticorpo, é adicionaso um anticorpo antiimunoglubilina marcado com um fluorocromo 4. ligação do anticorpo antiimunoglobulina com a imunoglobulina humana
6.3.2.2. utilizado para pesquisa de autoanticorpos em doenças difusas do tecido conjutivo, nas vasculites sistêmicas (ANCA) e no diagnóstico de infecções pelo Treponema pallidum, Tripanosoma cruzi
6.3.2.3. teste FAN
6.3.2.3.1. fator antinúcleo, conhecido também como anticorpos antinucleares (ANA)
6.3.2.3.2. presente no soro de pacientes que apresentam doenças autoimunes sistêmicas que afetam o tecido conjutivo
6.3.2.3.3. considerado marcador para o lúpus eritematoso sistêmico (LES), artrite reumatoide e hipotireoidismo (tireoidite de hashimoto)
6.3.2.3.4. detectado pela imunofluosrecência indireta
6.4. resultado
6.4.1. a leitura é feita em microscópio de imunofluoescência
7. imunoblot (ou western blotting)
7.1. definição
7.1.1. técnica de biologia molecular que utiliza anticorpos (imunoblot) para detecção de proteínas específicas
7.1.1.1. transferência moléculas previamente separadas em uma matriz (gel) para um suporte adsorvente (membrana)
7.2. etapas
7.2.1. 1. proteínas do lisado celular são colocadas num deterdente (SDS) para desnaturação e solubilização 2. as proteínas inseridas no gel de SDS-PAGE são separadas por tamanho 3. as proteínas do gel são transferidas para uma membrana que será bloqueada 4. as proteínas específicas presas na membrana são detectadas por anticorpos capazes de ligar na proteína desnaturada 5. os anticorpos ligados são revelados com anticorpo secundário anti-Ig conjugados com radioisótopo enzima ou fluorocromo
7.3. eletroforese em SDS-PAGE
7.3.1. SDS
7.3.1.1. detergente - dodecol sulfato de sódio
7.3.2. PAGE
7.3.2.1. gel de poliacrilamida para eletroforese
7.3.2.1.1. determina o peso molecular de uma proteína e separa as proteínas por tamanho molecular
7.3.3. definição
7.3.3.1. permite a separação de moléculas (DNA, RNA e proteínas) sob influcência de um campo elétrico aplicado sobre uma amtriz permeável
7.4. aplicações
7.4.1. verificar o silenciamento de uma proteína
7.4.2. diagnóstico de doenças (ex.: HIV)
7.4.3. expressão após clonagem
8. Citometria de fluxo
8.1. definição
8.1.1. ténica que permite avaliar propriedades físicas e biológicas de células em suspensão
8.1.1.1. permite estudar várias caractéristicas de uma célula de forma rápida e por vários parâmetros (multiparamétrica)
8.1.1.1.1. realizada por meio da incubação das células com anticorpos conjugados a fluorocromos, que permite identificar e caracterizar diferentes populações celulares
8.2. aplicações
8.2.1. imunofetipagem
8.2.2. estudo da viabilidade celular
8.2.3. proliferação celular
8.2.4. marcação intracelular
8.2.5. ciclo celular
8.2.6. aplicação clínica
8.2.6.1. acompanhamento de pacientes com HIV (contagem de CD4)
8.2.6.2. caracterização de clone de HPN (hemoglobinúria paroxística noturna)
8.2.6.3. avaliação de subtipos linfocitários
8.2.6.4. caracterização de imunodeficiências
8.3. conjunto de sistemas
8.3.1. fluídos
8.3.1.1. introduz e alinha as partículas para análise
8.3.2. óptico
8.3.2.1. gera e coleta os sinais de luz
8.3.3. eletrônico
8.3.3.1. converte os sinais ópticos em sinais eletrônicos para análise em computador (software)
8.4. equipamento
8.4.1. citômetro de fluxo
8.4.1.1. o material disperso em meio líquido passa pela coluna e recebe um feixe de luz. Ao incidir sobre a célula marcada com anticorpos e seus respectivos fluorocromos, o feixe de luz sofre uma dispersão que será captada por diferentes detectores. Por sua vez, esses detectores transformarão os sinais luminosos recebidos em sinais eletrônicos passíveis de serem analisados em computador.
9. Aglutinação direta e indireta
9.1. definição
9.1.1. imunoensaios que objetivam avaliar a formação de agregados vísiveis a olho nu ou microscópio
9.1.1.1. resultantes da ligação entre anticorpos específicos a antígenos presentes em partículas solúveis
9.2. é considerado imunoensaio de aglutinação
9.3. necessário
9.3.1. veículo, antíngeno e anticorpo (maioria IgM)
9.4. aglutinação direta
9.4.1. utiliza-se partículas antigênicas insolúveis em suas forma íntegra ou fragmentada
9.4.2. podem ser aglutinados
9.4.2.1. hemácias, bactérias, fungos, protozoários (veículos)
9.4.3. pode ser feita diluição seriada (semi-quantitativo)
9.4.4. tipos de reações
9.4.4.1. tipagem de grupos sanguíneos ABO e RH
9.4.4.2. reação de Paul-Bunnel-Davidsohn (EBV)
9.4.4.3. teste de Widal (salmonelose)
9.5. aglutinação indireta
9.5.1. podem ser sensibilizados
9.5.1.1. hemácias ou partículas inertes, como o látex, podem ser sensibilizadas por adsorção conjugação dos antígenos
9.5.2. exemplo
9.5.2.1. VDRL
9.5.2.1.1. reagentes
9.5.2.1.2. realizada em placas de Kline
9.5.2.1.3. etapas
9.5.2.1.4. resultados
9.5.2.1.5. efeito prozona
9.5.2.1.6. utilidade
9.5.3. pra que serve
9.5.3.1. utilizado na pesquisa de anticorpos contra trypanosoma cruzi, t. pallidum, stepctococcus do grupo A, fator reumatoide e PCR
9.6. dica
9.6.1. se o antígeno faz parte do veículo = direta se alguem pegou o antígeno e colocou no veículo é indireta