PROTOCOLO DE IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS

1. Hemocultivos

1.1. Es una prueba de laboratorio quese realiza para detectar la presencia de microorganismos, fundamentalmente bacterias y hongos, en una muestra de sangre.

1.2. Recogida de la muestra

1.2.1. La extracción de la muestra se realiza por punción periférica venosa en el antebrazo. Se recogen dos o tres frascos de cada tipo en tres tomas a intervalos de 1 hora entre ellas.

1.2.1.1. Volumen de la muestra

1.2.1.1.1. Neonatos a 1 año, 0,5 a 1 ml

1.2.1.1.2. Entre 1 y 6 años, 1 ml/ año divididos en 2 frascos

1.2.1.1.3. Jóvenes, 10 ml divididos en 2 frascos.

1.2.1.1.4. Adultos, 20-30 ml divididos en 2 ó 3 frascos

1.2.2. La recogida de la muestra se debe realizar en condiciones de asepsia y en frascos especiales para hemocultivo

1.2.2.1. Los frascos con tapón rojo: cultivos anaerobio Los frascos con tapón azul: cultivo aerobio

1.2.3. Cada frasco contiene medios de cultivo y anticoagulante

1.2.3.1. El mejor anticoagulante y el que más se suele utilizar es el polianetol sulfonato de sodio (SPS).

1.2.4. En el interior de los tubos se mantiene una atm y una atmósfera interior controlada, pudiendo ser aerobios o anaerobios

1.2.5. El material de los frascos es vidrio o plástico

1.2.6. Tras la inoculación se ventila uno de los frascos con una aguja, haciendo que entre oxígeno en su interior y se genere una atmósfera aerobia.

1.2.7. Los frascos se incuban durante 7 días, con una temperatura óptima de entre 35 o y los 37 o C.

1.3. Protocolo de laboratorio

1.3.1. Examen directo

1.3.1.1. Una vez al día durante 7 días debemos observar la presencia de:

1.3.1.1.1. Turbidez

1.3.1.1.2. Hemólisis

1.3.1.1.3. Gas

1.3.1.1.4. Velo

1.3.1.1.5. Coágulo

1.3.1.1.6. Colonias visibles

1.3.1.2. Microorganismos asociados al aspecto de los cultivos

1.3.1.2.1. Hemólisis

1.3.1.2.2. Turbidez

1.3.1.2.3. Formación de gas

1.3.1.2.4. Formación de velo

1.3.1.2.5. Coágulo

1.3.1.2.6. Colonias visibles (puntiformes)

1.3.2. Inoculación

1.3.2.1. 1. Se procede a una aspiración aséptica de 3 a 5 ml del contenido del frasco y se introduce en un tubo estéril

1.3.2.2. 2. Se deposita una gota sobre un portaobjetos.

1.3.2.3. 3. Realizamos una tinción gram

1.3.2.4. 4. Observación al microscopio, determinando si son Gram + o - y el agrupamiento

1.3.2.4.1. Nos permite detectar si se trata de una infección polimicrobiana y determinar los medios de cultivo que debemos sembrar

1.3.2.4.2. Si no se detecta microorganismos se procede a realizar otra tinción con naranja de acridina

1.3.2.5. 5. Por último se realiza la siembra del líquido aspirado en diferentes medios de cultivo

1.3.2.5.1. Cocos gram +

1.3.2.5.2. Bacilo gram +

1.3.2.5.3. Cocos gram -

1.3.2.5.4. Bacilo gram -

1.3.2.5.5. Como medio anaerobio se puede utilizar Tioglicolato.

1.3.2.5.6. Otros medios

1.3.2.5.7. Condiciones de cultivo en cada medio

1.3.2.5.8. Además se hacen los cultivos adicionales necesarios según los hallazgos que se hayan hecho en la observación microscópica

1.4. Bacterias en hemocultivos

1.4.1. Staphylococcus aureus

1.4.2. Escherichia coli

1.4.3. Estafilococos coagulasa negativa

1.4.4. Klebsiella pneumoniae

1.4.5. Enterococcus spp

1.4.6. Pseudomonas aeruginosa

1.4.7. Streptococcus pneumoniae

1.4.8. Streptococcus del grupo viridans

1.4.9. Streptococcus pyogenes

1.4.10. Candida albicans

2. Muestras respiratorias

2.1. Podemos obtener muestras respiratorias bien de :

2.1.1. Vías altas

2.1.1.1. Exudado faringeo

2.1.1.2. Exudado nasal

2.1.2. Vías bajas

2.1.2.1. Esputo

2.1.2.2. Aspirado traqueal y bronquial

2.1.2.3. Cepillado bronquial

2.1.2.4. Punción y punción transtraqueal

2.2. Recogida de la muestra

2.2.1. Exudado faríngeo

2.2.1.1. 1º Emplear un depresor lingual para visualizar correctamente la boca y la garganta

2.2.1.2. 2º Con ayuda de un hisotopo tomar una determinada cantidad de muestra de la faringe posterior y las criptas tonsilares

2.2.1.3. 3º Evitar tocar la mucosa oral y la lengua durante la recogida de la muestra para que esta no se contamine

2.2.1.4. 4º En función de las determinaciones analíticas que se vayan a realizar :

2.2.1.4.1. Cultivo habitual

2.2.1.4.2. Sospecha de Bordetella pertussis

2.2.1.4.3. Cultivo de virus

2.2.1.4.4. Cultivo de Neisseria gonorrhoeae

2.2.1.5. 5º La conservación de la muestra

2.2.1.5.1. Bacterias y Hongos

2.2.1.5.2. S. pyogenes:

2.2.2. Exudado nasal

2.2.2.1. 1º Introducir 1 cm de hisotopo en la cavidad nasal

2.2.2.2. 2º Girar el hisotopo con delicadez por la mucosa nasal durante 10 o 15 segundos

2.2.2.3. 3º Introducir el histopo en un tubo que contenga el medio de transporte requerido

2.2.2.4. 4º La muestra se conserva a temperatura ámbiente y debe entregarse en el laboratorio en las 2 horas posteriores a la extracción

2.2.3. Esputo

2.2.3.1. Muestra para el cultivo

2.2.3.1.1. 1º Lavar y enjugar la boca

2.2.3.1.2. 2º Tomar una muestra matinal por expectoración espontáneo o inducida y depositarla en el envase determinado

2.2.3.1.3. 3º Rotular la muestra

2.2.3.1.4. 4º Conservar refrigerada

2.2.3.2. Muestra para micobacterias

2.2.3.2.1. 1º Lavar y enjugar la boca

2.2.3.2.2. 2º Tomar una muestra matinal por expectoración espontánea o inducida y depositarla en un envase determinado

2.2.3.2.3. 3º Rotular la muestra

2.2.3.2.4. 4º Repetir este proceso durante 3 días diferentes

2.2.3.2.5. 5º Conservar las muestras refrigeradas

2.3. Protocolo de laboratorio

2.3.1. Exudado faríngeo

2.3.1.1. 1º Sembrar en AGAR COLUMBIA

2.3.1.2. 2º Cultivar durante 48 horas a 37 º en un ámbiente anaerobio

2.3.1.3. 3º Realizar una tinción Gram

2.3.1.4. 4º Si se observa infección por Haemophilus influenzae se cultivara en Agar Martin Lewis

2.3.2. Exudado nasal

2.3.2.1. 1º Realizar los cultivos bien en AGAR SANGRE o AGAR MANITOL

2.3.2.2. 2º Realizar una siembra en superficie

2.3.2.3. 3º Incubar durante 24 horas a 37 º

2.3.3. Esputo

2.3.3.1. 1º Observación de las características macroscópicas de la muestra

2.3.3.2. 2º Homogeneizar la muestra y tomar una cantidad determinada de la parte mas purulenta

2.3.3.3. 3º Extender la muestra en un portaobjetos

2.3.3.4. 4º Realizar una tinción de Gram o de ziehl neelsen

2.3.3.5. 5º Observar al microscopio

2.3.3.6. 6º Sembrar en el medio de cultivo determinado en función de la bacteria identificada

2.3.3.6.1. Los más habituales son

2.4. Bacterias en muestras respiratorias

2.4.1. Exudado faríngeo

2.4.1.1. Estreptococo beta hemolítico

2.4.1.2. Streptococcus pyógenes

2.4.1.3. H. influenzae

2.4.1.4. S. pneumoniae

2.4.1.5. Mycobacterium catarrhalis

2.4.1.6. Candida albicans

2.4.1.7. Neisseria meningitidis

2.4.2. Exudado nasal

2.4.2.1. Streptococcus viridans

2.4.2.2. Staphylococcus aureus

2.4.2.3. Staphylococcus coagulasa negativa

2.4.2.4. Corynebacterium sp

2.4.3. Esputo

2.4.3.1. Staphylococcus aureus

2.4.3.2. Bacilos Gram Negativos no esporulados

2.4.3.3. Bacilos Gram Negativos

2.4.3.4. Enterobacterias

2.4.3.5. Morazella catarrhalis

2.4.3.6. Hamophius influenzoe

2.4.3.7. Estreptococcus pneuminioe

3. Exudados vaginales

3.1. Es un examen de laboratorio empleado para identificar bien la presencia o la ausencia de una infección junto con el patógeno desencadenante de la misma.

3.2. Recogida de la muestra

3.2.1. 1º Introducir un espéculo vaginal sin lubricación

3.2.2. 2º Con ayuda de un isótopo extraer de la zona con mayor cantidad de exudado la cantidad de muestra requertida

3.2.3. 3º Colocar el isótopo en el tubo de medio de transporte y etiquetar. Esta muestra esta destinada a la observación microscópica

3.2.4. 4º Con un isótopo nuevo, repetir el procedimiento anterior. Esta muestra, sin embargo, se encuentra destinada al estudio microbiológico.

3.2.5. 5º Finalmente, con ayuda de una pipeta recoger muestra del saco vaginal y depositar en un tubo con suero fisiológico. Esta muestra se emplea en el estudio en fresco ( Trichomonas vaginales ).

3.2.6. Las muestras obtenidas se deben de enviar al laboratorio inmediatamente.

3.2.6.1. Si no se pueden analizar antes de los 15 minutos posteriores a la extracción, se deben de emplear isótopos con un medio de transporte determinado que permite conservar las muestras a temperatura ambiente o a 37º en una estufa durante 6 horas.

3.2.6.2. La muestra destinada al examen en fresco puede conservarse durante 1 hora aproximadamente en una estufa a 37 º

3.3. Protocolo de laboratorio

3.3.1. ESTUDIO MICROSCÓPICO

3.3.1.1. 1º Realización de un frotis del escobillón donde se localiza la muestra

3.3.1.2. 2º Tinción Gram

3.3.1.2.1. Este estudio revela el estado de la microbiota vaginal así como la presencia de :

3.3.1.3. 3º Realización de un recuento celular para determinar la presencia de Vaginosis bacteriana.

3.3.1.3.1. Lactobacillus

3.3.1.3.2. Cocobacillus Gram ( + o -)

3.3.1.3.3. Bacilos Gram Negativos Curvados

3.3.1.4. 4º Interpretación de los resultados obtenidos

3.3.1.4.1. 0 a 3 : Estado normal de la flora vaginal

3.3.1.4.2. 4 a 6 : Flora vaginal alterada

3.3.1.4.3. 7 a 10 : Presencia de Vaginosis Bacteriana

3.3.2. CULTIVO

3.3.2.1. La incubación se realiza durante 18 o 24 horas a 37º o 30 º en función del agar empleado

3.3.2.2. En el caso de no observar patógenos en las primeras 24 horas se incuba hasta alcanzar las 48 horas

3.3.2.3. Los medios de cultivos más empleados son

3.3.2.3.1. AGAR MCCONKEY

3.3.2.3.2. AGAR DEXTROSA SABOREAUD

3.3.2.3.3. AGAR SANGRE

3.4. Bacterias presentes en orina

3.4.1. Gardnerella vaginalis

3.4.1.1. Bacilo

3.4.2. Candida ssp

3.4.2.1. Levadura

3.4.2.2. Se diagnostican con : Tinción Gram y examen en fresco

3.4.3. Trichomonas vaginales

3.4.3.1. Parásito flagelado móvil

3.4.4. Streptococcus agalactiae (SGB).

3.4.4.1. Colonias de coloración naranja

3.4.4.2. Se cultivan en agar sangre

3.4.4.3. Prueba de la catalasa = Negativa

3.4.5. Neisseria gonorrhoeae

3.4.5.1. Diplococos negativo

3.4.5.2. Prueba de la oxidasa : postiva

4. Urocultivos

4.1. Es un examen de laboratorio empleado para analizar si hay bacterias u otros microbios en una muestra de orina. Con el urocultivo se pretende diagnosticar infecciones urinarias.

4.2. Recogida de la muestra

4.2.1. El recipiente en el que se recoja la muestra debe de ser estéril y se debe descartar el primer chorrro de orina.

4.2.2. Se requieren 10 mL aproximadamente

4.2.3. Hasta su utilización se debe mantener a 4ºC durante 48 horas

4.3. Protocolo de laboratorio

4.3.1. ESTUDIO SEMICUANTITATIVO

4.3.1.1. 1º Homogeneizar la orina evitando la formación de espuma

4.3.1.2. 2º Sembrar en superficie 10 μL en MEDIO CLED

4.3.1.3. 3º Tomar inóculo y distribuir por la placa creando un radio

4.3.1.4. 4º Distribuir el inóculo realizando zig-zag de lado a lado de la placa desde arriba hasta el centro de la placa

4.3.1.5. 5º Sin despegar el asa realiza estrías más separadas repitiendo el movimiento de zig-zag

4.3.1.6. 6º Incubar 24 horas a 37ºC

4.3.1.7. 7º Comparar los patrones de referencia para determinar: - En la mitad superior: 25000 UFC/mL - Crecimiento en toda la línea central: 50000 UFC/mL - Crecimiento línea central y mitad superior: 75000 UFC/mL - Crecimiento general: POSITIVO: 100000 UFC/mL Resultados, menor de 10^4 UFC/ml negativo y >10^5 UFC/ml positivo

4.3.1.8. Además, se siembra una placa de agar McConkey, se incuba 24 h a 37ºC, se realiza tinción gram y pruebas bioquímicas

4.3.1.8.1. Cocos Gram +

4.3.1.8.2. Bacilos Gram -

4.3.1.8.3. Levaduras

4.4. Bacterias en orina

4.4.1. Enterobacterias

4.4.1.1. Escherichia coli Klebsiella spp Enterobacter spp Proteus spp Serratia spp

4.4.2. BNNF

4.4.2.1. Pseudomonas aeruginosa Acinetobacter spp

4.4.3. Cocos Gram +

4.4.3.1. Enterococcus spp Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Estrectocococ agalactiae (embarazadas)

5. Coprocultivos

5.1. El coprocultivo es un examen de laboratorio para encontrar organismos en las heces (materia fecal) que puedan causar enfermedad y síntomas gastrointestinales.

5.2. Recogida de la muestra

5.2.1. Se requiere una toma de una muestra fecal en un recipiente estéril. El paciente debe orinar previamente a la defecación dado que las heces mezcladas con orina no serán útiles para el estudio

5.2.2. Hay diferentes métodos para la recogida de la muestra, pero se recomienda el uso de de un recolector de heces de plástico estéril coloca sobre el bidé o bien sobre un recipiente previamente desinfectado.

5.2.3. Recoger una cantidad de heces del tamaño de una nuez (aproximadamente 1g de heces) en un frasco estéril de boca ancha con tapón de rosca.

5.2.4. Los recipientes poseen una pequeña cucharilla que facilita el depósito de la muestra.

5.2.5. Para el estudio de parásitos de heces

5.2.5.1. Se deben recoger tres muestras de días alternos (no consecutivos).

5.2.5.2. Dependiendo del tipo de parásitos

5.2.5.2.1. Agentes virales

5.2.5.2.2. Agentes bacterianos

5.2.5.2.3. Estudios parasitoscópicos

5.3. Protocolo de laboratorio

5.3.1. Examen Directo

5.3.1.1. 1º Realizar un estudio macroscópico

5.3.1.2. 2º Posteriormente, realizar un estudio microscópico en fresco o con azul de metileno

5.3.1.2.1. También se puede emplear tinción Gram

5.3.1.3. 3º Se puede realizar la prueba de guayacol para observar sangre oculta en heces

5.3.1.3.1. Tarjeta de ESOH con una sustancia proveniente de una planta

5.3.2. Inoculación

5.3.2.1. 1º Emulsión de 1-2 g de heces en solución salina

5.3.2.2. 2º Se siembra en los siguientes medios

5.3.2.2.1. Caldo selenito

5.3.2.2.2. Aislamiento

5.3.2.2.3. Pruebas bioquímicas

5.3.2.2.4. Medio Cin

5.3.2.2.5. Agar hierro de Kliger

5.3.2.3. 3º Tras un periodo de 24-48 horas se observará el crecimiento de las colonias cultivadas macroscópicamente y al microscopio.Se procede a realizar pruebas bioquímicas pra su identificación.

5.3.2.4. Se procede a realizar pruebas bioquímicas para su identificación.

5.4. Bacterias en coprocultivo

5.4.1. Gastroenteritis

5.4.1.1. Vómitos Fiebre Cólicos estomacales

5.4.1.1.1. Rotavirus Staphylococcus spp Bacillus cereus

5.4.2. Enteritis

5.4.2.1. Dolor abdominal Diarrea aguda y grave. Falta de apetito Vómito Sangre en las heces

5.4.2.1.1. Escherichia coli (enterotoxigénica) Vibrio cholerae

5.4.3. Disentería, colitis

5.4.3.1. Pequeños volúmenes de materia fecal conteniendo sangre y/o mucus y leucocitos abundantes. Dolor abdominal Inflamación de intestinos y colon Heces acuosas.

5.4.3.1.1. Shigella spp Campylobacter spp Salmonella spp E.coli invasiva Plesiomonas shigelloides Aeromonas hydrophila Vibrio parahaemolyticus Clostridium difficile Entamoeba histolytica

6. Muestras de líquidos estériles

6.1. Líquido cefalorraquídeo

6.1.1. Es un líquido incoloro que baña el encéfalo y la médula espinal. Actúa como amortiguador y se encuentra en las superficies externas del encéfalo y la médula espinal.

6.1.2. Recogida de la muestra

6.1.2.1. Se obtiene por punción percutánea lumbar (vertebras L3-L4 o L4-L5)

6.1.2.1.1. Otros métodos para la obtención de la muestra son

6.1.2.2. Se recoge la mayor cantidad de líquido posible

6.1.2.3. Debe mantenerse en condiciones de asepsia (Se puede mantener a 4ºC)

6.1.2.4. Se envía a laboratorio de manera inmediata

6.1.3. Protocolo de laboratorio

6.1.3.1. 1º Se realiza un conteo de las células

6.1.3.2. 2º Se centrifuga y se siembra en diferentes medios

6.1.3.2.1. Agar sangre

6.1.3.2.2. Agar chocolate

6.1.3.2.3. Caldo tioglicolato

6.1.3.3. 3º Se incuba

6.1.3.4. 4º Se observa y se procede a teñir

6.1.3.5. 5º Se realizan pruebas adicionales dependiendo del medio en que ha habido crecimiento

6.1.4. Bacterias en líquido cefalorraquídeo

6.1.4.1. Síndrome: meningitis bacteriana aguda

6.1.4.1.1. < 2 meses

6.1.4.1.2. 2 meses - 10 años

6.1.4.1.3. Adultos