1. Material biológico
1.1. Marchantia polymorfa
1.2. Physocomitrella patens
1.3. Selaginella martensii
2. Metodología
2.1. Extracción de proteínas totales
2.1.1. Para obtener las proteínas totales se usaron los talos de M. polymorfa, los gametofitos de P. patens y los frondos de S. martensii
2.1.2. Se homogeiniza usando un tampón Tris HCl 50 mM EDTA 1 mM y KCl 1M pH 7.5 prop. 1:2 p/v
2.1.3. Se añade 0.05 g/peso fresco de tamón PVPP (polivinilpolipirrolidona: efecto oxidativo). Todo el procedimiento a 4°C
2.1.4. Se filtra a través de dos gasas previamente enfriada, se descarta el material retenido y el filtrado se centrifuga por 40 mins. a 1 5000 g descartando el precipitado.
2.1.5. El sobrenadante se dializó toda la noche con un tampón TRIS HCl 50 mM pH 7.5
3. Metodología parte II
3.1. Purificación de peroxidasas
3.1.1. La obtención de las proteínas se realizó mediante una precipitación fraccionada con sulfato de amonio.
3.1.2. La solubilidad que presentan las proteínas en función de laa concentración de sales. M. polymorfa 0, 50, 65 y 95% (P. patens y S. martensii a concentración de 25, 40, 50, 65 y 80 %). Precipitado bajo concentración durante una hora y media a 4°C a 27 000 g por 20 mins.
3.1.3. El precipitado se conservó, mientras que el sobrenadante de esta 1° centrifugación se utilizó para precipitar el material con una concentración superior de sulfato amónico, en las condiciones descritas anteriormente, realizándose de manera análoga los sgtes pasos.
3.1.4. Cada precipitado se resuspende en tampón Tris HCl 50 mM pH 7.5 y se dializó toda la noche con al mismo tampón. Se concentra empleando filtros de membrana y luego se purifica por un sistema de cromatografía
4. Metodología parte III
4.1. Purificación parcial de peroxidasas de M. polymorpha
4.1.1. Cromatografía hidrofóbica sobre Fenil-Sefarosa TM6 Fast Flow
4.1.1.1. Fue empaquetada y equilibrada con sulfato amónico 1,5 M en Tris-HCl 50 mM pH 7,5. La muestra procedente de la extracción del material vegetal, ya preparada con una concentración de 1,5 M de sulfato amónico, se aplicó sobre el gel. Tras aplicar la muestra de proteína, la cromatografía se realizó con el siguiente gradiente decreciente de sulfato amónico: i) 100% de tampón A, minutos 0-130, ii) 0-100% de tampón B, minutos 130-330; y iii) 100% de tampón B, minutos 330-480; utilizándose como tampón A sulfato amónico 1,5 M en Tris-HCl 50 mM pH 7,5, y como tampón B, Tris-HCl 50 mM pH 7,5. La cromatografía se realizó a un flujo de 1 ml min-1 recogiéndose fracciones de 5 ml.
5. Metodología parte IV
5.1. Purificación parcial de peroxidasas de M, polymorfa
5.1.1. Cromatografía de intercambio iónico sobre SPSefarosaTM Fast Flow
5.1.1.1. Fue empaquetada y equilibrada con tampón Tris-HCl 25 mM pH 8,2. La muestra procedente de la cromatografía hidrofóbica se concentró y simultáneamente se dializó frente a un tampón Tris-HCl 25 mM pH 8,2, usando el sistema de filtros de membrana Amicon Ultra-15. Tras aplicar la muestra, la cromatografía se realizó con un programa que incluyó un gradiente ascendiente de cloruro potásico. Este gradiente consistía en: i) 0% de tampón B, minuto 0-104; ii) 0-100% de tampón B, minuto 104-204; y iii) 100% de tampón B, minuto 204-325; siendo el tampón A Tris-HCl 25 mM pH 8,2, y el tampón B, Tris-HCl 25 mM pH 8,2 con KCl 0,5 M. La cromatografía se llevó a cabo a un flujo de 1 ml min-1 recogiendose fracciones de 1 mL