1. Método de determinación de proteínas
1.1. Utilización del factor de conversión
1.1.1. Determinar el contenido de nitrógeno total y multiplicar por un factor de conversión de nitrógeno a proteína.
1.1.2. Determinar el contenido de nitrógeno proteico y multiplicar por un factor de conversión de nitrógeno a proteína
1.1.3. Diálisis y ultrafiltración por membrana
1.1.4. Coagulación por calor (no es efectivo para caseína y gelatina)
1.1.5. Uso de agentes precipitantes como: ácido túngstico, ácido tricloroacético, hidróxido de cobre, óxido férrico, acetato de plomo, ácido fosfotúngstico, ácido metafosfórico, ácido tánico, ácido sulfosalicílico, etanol, mezcla cloroformo y octanol (8:1), mezcla fenol, ácido acético y agua (1:1:1).
2. Métodos químicos
2.1. Método de Biuret
2.1.1. Principio químico
2.1.1.1. La reacción se caracteriza por una coloración púrpura cuando los iones cúpricos son complejados por los enlaces peptídicos a pH alcalino
2.1.1.2. El matiz del color depende del tipo de proteína y su intensidad depende del contenido de proteína presente
2.1.2. Reactivo utilizado
2.1.2.1. Solución alcalina conteniendo iones cúpricos complejados con tartrato de sodio y potasio.
2.1.3. Lectura
2.1.3.1. 550 nm, a 263 nm se aumenta la sensibilidad en 10 veces.
2.1.4. Desventaja
2.1.4.1. Poca aplicación en análisis de alimentos debido a la presencia de interferentes como azúcares reductores que reducen el ion cúprico en medio alcalino produciendo resultados insatisfactorios. Ejemplo: leche
2.1.5. Aplicaciones
2.1.5.1. Cereales
2.1.5.2. Carne
2.1.5.3. Proteínas de las semillas de soja
2.2. Método "dye-binding"
2.2.1. Principio químico
2.2.1.1. Formación de un coágulo de proteína coloreado e insoluble producto de la reacción de la proteína con una solución coloreada de ácido sulfónico a pH 2.
2.2.1.2. El anión coloreado se une por asociaciones electrostáticas a los sitios básicos de la proteína, por ejemplo a los grupos Mamino de lisina, guanidina de arginina, imidazol de histidina y aminos terminales.
2.3. Método de destilación alcalina
2.3.1. Fundamento
2.3.1.1. La hidrólisis de las amidas en medio alcalino fuerte da origen a amoníaco el cual es destilado y su valor es relacionado con el contenido de proteína.
2.3.2. Se ha encontrado que el rendimiento de amonio es altamente reproducible para una proteína dada
2.4. Método de Lowry
2.4.1. Fundamento
2.4.1.1. Cuando se agrega reactivo de Folin a una proteína, ésta se reduce a un complejo azul de molibdeno por la oxidación de los aminoácidos tirosina, triptófano, cistina, cisterna e histidina.
2.4.2. Lectura: 750 nm
2.4.3. Ventajas
2.4.3.1. Alta sensibilidad
2.4.3.2. Simple de operar
2.4.4. Aplicaciones
2.4.4.1. Bioquímica de las proteínas
2.5. Método de Bradford
2.5.1. Fundamento
2.5.1.1. Azul brillante de Coomassie G-250, se una a las proteínas y cambia de color de rojizo a azulado, desde 465 hasta 595 nm.
2.5.1.2. Naturaleza anfótera de las proteínas
2.5.1.3. Tinte cambio en espectro de absorción, en comparación con el tinte no unido.
2.5.2. Aplicaciones
2.5.2.1. Productos de maltas y cervezas
2.5.2.2. Tubérculos como la papa
2.5.2.3. Cantidad de proteínas en microgramos
2.5.2.4. Purificación de las proteínas
2.5.3. Ventajas
2.5.3.1. Rápido: 2 minutos
2.5.3.2. Reproducible
2.5.3.3. Sensible
2.5.3.4. Mide los péptidos y proteínas con una masa molecular de 4000 Da.
3. Métodos físicos
3.1. Espectroscopía infrarroja
3.1.1. Fundamento
3.1.1.1. Se aprovecha la absorción del grupo amida del enlace peptídico a 6,46 Tm
3.1.2. Ventaja
3.1.2.1. Rápido, análisis de multicomponentes No destructivo
3.1.3. Desventajas
3.1.3.1. Interferido por agua. Proceso de calibración complejo.
3.2. Espectroscopia infrarroja reflectante
3.2.1. Fundamento
3.2.1.1. La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiación infrarroja (0,75-2,5 Tm) y se detecta la luz reflejada
3.2.2. Ventajas
3.2.2.1. Rápido, análisis de multicomponentes.
3.2.2.2. Aplicable a materiales sólidos.
3.2.2.3. Cuantifica proteína en presencia de agua
3.2.3. Desventajas
3.2.3.1. Interfieren almidones y lípidos.
3.2.3.2. Desplazamiento de espectro de reflectancia por humedad contenida en las partículas
3.2.3.3. Proceso de calibración complejo.
3.2.4. Aplicaciones
3.2.4.1. Proteínas de la leche
3.2.4.2. NIR: el trigo
3.2.4.3. Cereales
3.2.4.4. Carnes
3.2.4.5. Productos lácteos
3.3. Espectrofotometría ultravioleta
3.3.1. Fundamento
3.3.1.1. Mide proteínas en solución con absorción máxima a 280 nm atribuible a los anillos aromáticos de tirosina y triptófano y entre 180-220nm.
3.3.2. Ventajas
3.3.2.1. Rápido, no destructivo.
3.3.2.2. Útil para monitorear eluentes en columnas cromatográficas.
3.3.3. Desventajas
3.3.3.1. Interferencia de otros compuestos (ácidos nucleicos, nucleótidos).
3.3.4. Aplicaciones
3.3.4.1. Contenido en proteínas de la leche
3.3.4.2. Productos cárnicos
4. Métodos de determinación de nitrógeno total
4.1. Método de Kjeldahl
4.1.1. Uso de ebullición
4.1.2. Ácido sulfúrico concentrado
4.1.2.1. Destrucción oxidativa de la materia orgánica de la muestra
4.1.2.2. Reducción del nitrógeno orgánico a amoniaco
4.1.2.3. El amonio es retenido como bisulfato de amonio
4.1.2.3.1. Determinado por in situ o por destilación alcalina y titulación.
4.1.3. Dificultades
4.1.3.1. Digestión prolongada
4.1.3.2. Conversión cuantitativa de nitrógeno a amoniaco.
4.1.3.3. Espumosidad excesiva
4.1.3.4. Acción corrosiva
4.1.4. Catalizadores metálicos utilizados
4.1.4.1. Óxido de mercurio
4.1.4.2. Selenio o mezcla de sulfato de cobre y selenio
4.1.4.3. Mezcla de sulfato de cobre y selenio
4.1.4.4. Determinación de amonio
4.1.5. Ventajas
4.1.5.1. Apropiado para varios tipos de productos.
4.1.5.2. Alta fiabilidad.
4.1.5.3. Usado como método de referencia
4.1.6. Desventajas
4.1.6.1. Interfieren compuestos nitrogenados no proteicos.
4.1.6.2. Uso de catalizadores tóxicos o caros.
4.1.6.3. Elección del factor de conversión.
4.1.6.4. Mide el nitrógeno total
4.1.7. Aplicaciones
4.1.7.1. A todo tipo de alimentos
4.2. Método de Dumas
4.2.1. Se caracteriza por pirólisis completa de la muestra y medición del contenido de nitrógeno de los gases de combustión.
4.2.2. El nitrógeno puede ser medido con manómetro después de absorber el dióxido de carbono en una solución alcalina o por conductividad térmica en métodos automatizados.
4.2.3. Ventajas
4.2.3.1. Muestra equivalencias satisfactorias al compararlo con el método de Kjeldahl en análisis de forrajes y alimentos infantiles, aunque con valores levemente mayores
4.2.3.2. Puede ser llevado al cabo de 3 minutos
4.2.3.3. Instrumentos automatizados pueden analizar hasta 150 muestras
4.2.4. Desventajas
4.2.4.1. Incluye nitrógeno inorgánico
4.2.4.2. Requiere pequeñas cantidades de muestra 5-50 mg, finamente dividida y homogénea para minimizar el error de muestreo
4.2.4.3. No puede aplicarse a material húmedo por lo que debe efectuarse un secado previo
4.2.5. Aplicaciones
4.2.5.1. Granos de cereales
4.2.5.2. Carnes
5. Métodos radioquímicos
5.1. Activación neutrónica
5.1.1. Irradia una cantidad pesada de muestra con neutrones lo que produce el paso de l4 N a l3 N.
5.1.2. Este positrón tiene una vida media de 10 minutos y emite radiaciones gamma las que se registran en un contador de centelleo
5.1.3. Las cuentas se relacionan con el contenido de nitrógeno de la muestra.
5.1.4. Ventajas
5.1.4.1. Simple; rápido.
5.1.4.2. Sin problemas de contaminación.
5.1.4.3. Los valores encontrados presentan buena correlación con el método de Kjeldahl
5.2. Activación protónica
5.2.1. Similar al anterior con la variante de que la muestra se irradia con protones y se efectúa la conversión de 14Na140
5.2.2. Un isótopo que decae con la emisión de un protón y de radiaciones gamma las que son registradas y relacionadas con el contenido de nitrógeno de la muestra.