Highly efficient base editing in human tripronuclear zygotes

1. Las mutaciones de un solo gen que causan enfermedades se deben a sustituciones de un solo nucleótido o a mutaciones puntuales en lugar de indels.

2. Se usó BE38(rAPOBEC1) para inducir mutaciones en la B-globina humana (HBB), la edición de bases en cigotos 3PN humanos se realizó mediante microinyección de ARNm y ARNs de BE3.

2.1. Cigotos 3PN inyectados se cultivaron en embriones y e usaron para análisis de secuenciación profunda dirigida. el 42% tuvieron mutaciones dirigidas en el sitio diana en el gen HBB, con frecuencia de mutación que varió del 6% al 42%.

2.2. La secuenciación profunda dirigida mostró que 7 de 8 embriones para la edición de base de HBB contenían una mutación sin sentido en el sitio objetivo.

2.3. Para evitar sesgo e base PCR, se examinaron embriones de base FANCF o DNMT3B a nivel de una sola célula. Se aislaron blastómeros de embriones y se recogieron bajo el microscopio para amplificación por PCR y secuenciación de sanger. 10 de de 10 portaban mutaciones puntuales dirigidas en el sitio diana de gen FANCF o DNMT3B.

3. En comparación con CRISPR/cas9, aunque 7 de 10 embriones mutantes FANCF contenían alelos de indeles, el porcentaje de alelos con indels fue muy bajo para FANCF y 0% para DMNT3B. La optimización adicional de de los editores de base con mutante cas9 inactivo puede reducir los indeles.

4. En estudios se ha demostrado que la edición de genes mediada por CRISPR/Cas9podria introducir modificaciones genéticas precisas en embriones humanos tempranos. Se obtienen indels en lugar de sustituciones de un solo nucleótido, la mayoría de las roturas de doble hebra del ADN (DSB) producidas por nucleasas programables se reparan mediante unión de extremo no homólogos (NHEJ) en lugar de recombinación homologa (HR).

4.1. En conjunto los resultados indican que BE3 no indujo alteraciones simplificativas fuera del objetivo en embriones humanos editados genéticamente. La microinyección de de ARNm dio como resultado una edición de base eficiente y precisa en cigotos 3PN humanos. Los editores de base para corregir defectos genéticos en embriones humanos se pueden usar en el futuro.