Instrumentación para Espectroscopía de Fluorescencia

1. longitud de onda incidente

2. Espectros de emisión

2.1. medir la vida útil

2.1.1. prueba del filtro

2.1.1.1. luz dispersa

2.1.1.2. fluorescencia mínima.

2.1.2. tubos fotomultiplicadores (PMT)

2.1.2.1. componentes

2.1.2.1.1. Fotocátodo

2.1.2.1.2. Serie de dinodos

2.1.2.2. útiles para la detección de luz de bajo nivel

2.1.3. transmisión del monocromador

2.2. Detección

3. Introducción al espetrofluorímetro

3.1. Conceptos clave

3.1.1. Espectro de Emición

3.1.2. Espectro de Excitación

3.1.3. Energía de la Luz

3.2. Componentes espectrofluorometro

3.2.1. Lampara de Xenón

3.2.2. Monocromadores

3.2.3. Monocromador de excitación

3.2.4. Foto Multiplicador

3.2.5. Sistema de lentes

3.3. Espectrofluorómetro de alto rendimiento

3.3.1. Mismo fundamento, pero con unas alteraciones de diseño

3.3.2. Fibra óptica y espejo con un orificio

3.3.3. Análisis de muchas muestras

3.4. Espectroflurómetro ideal

3.4.1. Fuente de energía

3.4.1.1. emisión constante

3.4.2. Monocromador

3.4.2.1. paso de todas las longitudes de onda

3.4.3. Eficiencia independiente de polarización

3.4.4. Foto Multiplicador

3.4.4.1. detectar todas las longitudes de onda

3.5. Distorsiones en la excitación y los espectros de emisión

3.5.1. Intensidad de la Luz de Transmisión

3.5.2. Eficiencia de transmisión de monocromadores

3.5.3. DO depende de la geometría de la muestra (0.1)

3.6. Filtros ópticos y pureza de señal

3.6.1. errores

3.6.1.1. Luz dispersa

3.6.1.2. Luz parásita

3.6.1.3. Impureza de la muestra

3.6.1.4. Interferencia

3.6.1.5. dispersión Raman

3.6.2. correcciones

3.6.2.1. filtro de emisión

3.6.2.2. filtro óptico

3.6.2.3. experimentos de control

3.6.2.4. emisión

3.6.2.4.1. monocromador

3.6.2.4.2. filtro

3.6.2.4.3. Espectro de Excitación

4. Respuesta espectral

4.1. depende

4.1.1. diferencias en el material fotocátodo

4.1.1.1. bialcalino

4.1.1.2. multialcalinos

4.1.1.3. multialcalinos rojos

5. Componentes

5.1. Fuentes de luz

5.1.1. Lámpara de xenón con λ = 250nm

5.1.2. Lámparas de xenón pulsadas

5.1.3. Lámparas de mercurio de alta presión

5.1.4. Lámparas de baja presión Hg y Hg – Ar

5.1.5. Fuentes de luz LED

5.1.6. Diodos láser

5.2. Monocromadores

5.2.1. Dispersa la luz blanca

5.2.1.1. Prismas

5.2.1.2. Rejillas de dispersión

5.2.1.2.1. Fundamento

5.2.1.2.2. Tipos

5.3. Filtros ópticos

5.3.1. Características

5.3.1.1. Compensan deficiencias del monocromador

5.3.1.2. Especificidad para conjuntos de fluoróforos

5.3.1.3. Son "vidrios coloreados"

5.3.2. Colores

5.3.2.1. Transmiten todas las longitudes de onda que estén arriba de la deseada

5.3.2.2. Su nombre se asigna por su color

5.3.3. Tipos

5.3.3.1. Película delgada

5.3.3.1.1. Transmiten o reflejan la luz del láser

5.3.3.2. Largo paso

5.3.3.2.1. Transmisión de la luz sobre325 o 488 nanómetros

5.3.3.2.2. Proporcionan máxima sensibilidad

5.3.3.3. Muesca

5.3.3.3.1. Elimina la luz dispersa

5.3.3.3.2. Transmite todas las longitudes de onda excepto la del láser

5.3.3.4. Densidad neutra

5.3.3.4.1. Atenuan la luz por igual

5.3.3.4.2. Actúan sobre todas las longitudes de onda

5.3.3.5. Para fluorescencia

5.3.3.5.1. Son sustitutos del monocromador

5.3.4. Combinación de filtros

5.3.4.1. Necesarios para mayor especificidad

5.3.4.2. Optimizan el rechazo de luz no deseada

5.4. Tubos Fotomultiplicadores

5.4.1. Detectan la fluorescencia

5.5. Polarizadores

5.5.1. Función

5.5.1.1. Convierten la luz no polarizada en polarizada

5.5.1.1.1. permiten el paso de una única onda electromagnética

5.5.2. Tipos

5.5.2.1. Polarizador Glan-Thompson

5.5.2.1.1. Componentes

5.5.2.2. Películas polarizadas

5.5.2.2.1. Compuestas de polímeros

6. Problemas y corrección

6.1. Efectos de la geometría de la muestra

6.1.1. Observación en ángulo recto

6.1.1.1. Tipo de geometría más usada en la fluorescencia.

6.1.2. Iluminación frontal

6.1.2.1. Se realiza utilizando celdas triangulares o cuadradas, orientadas de 30° a 60° con respecto al haz incidente.

6.1.3. Iluminación descentrada

6.1.3.1. Disminuye la longitud de la trayectoria.

6.2. Corrección del espectro de excitación

6.2.1. Instrumentos

6.2.1.1. Polarizador Glan-Thompson

6.2.1.2. Tubos fotomultiplicadores

6.2.2. Quimicos

6.2.2.1. Contadores cuánticos

6.2.2.1.1. Homogenizar

6.2.2.1.2. Controlar

6.3. Corrección del espectro de emisión

6.3.1. 4 Formas de corregirlo

6.3.1.1. Comparación de espectros conocidos

6.3.1.1.1. Análisis

6.3.1.2. Utilización de lampara estándar

6.3.1.2.1. comparación

6.3.1.3. Usar Quantum contador y espaciador

6.3.1.3.1. Se mide

6.3.1.4. Conversión de longitud de onda (λ) a numero de onda (y)

6.3.1.4.1. Son inversamente proporcionales (cm-1)

6.4. Normas de rendimiento cuántico

6.4.1. Rendimiento cuántico de un fluoroforo

6.4.1.1. comparación con estándares conocidos

6.4.1.1.1. se miden las longitudes de ondas en base a la intensidad de la muestra problema y los estándares conocidos

6.5. Problemas en las soluciones

6.5.1. Demasiada concentración

6.5.2. Soluciones altamente absorbentes

6.5.3. Observaciones en ángulo recto

6.5.3.1. Rendimiento cuántico de la especie

6.5.4. Impurezas en la muestra

6.5.4.1. La estructura y el entorno influyen

6.5.5. Partículas desplazantes

6.5.5.1. Interfieren con el detector

6.6. Problemas con la luz

6.6.1. Intensidad del haz incidente

6.6.2. Dispersión de Rayleigh

6.6.3. Dispersión de Raman

6.6.4. Luz errante (stray light)

6.6.5. Transmisión de segundo orden

7. Ley de Lambert-Beer

7.1. medición de la luz

7.1.1. Mezcla de fluoróforos

7.1.2. absorción y transmisión

7.2. propiedades del material atravesado

7.3. relaciona:

7.3.1. 1) luz entrante

7.3.2. 2) el medio correspondiente

7.3.3. 3) absorción del medio

7.3.4. 4) luz saliente

7.4. líquidos y gases

7.5. Desviaciones

7.5.1. instrumentales

7.5.1.1. luz errante

7.5.1.1.1. Altas densidades ópticas

7.5.2. intrínsecas

7.5.2.1. muestras biológicas turbias

7.5.2.1.1. macromoléculas u agregados

7.5.2.1.2. dispersan la luz

7.5.2.1.3. 1 / λ4 Rayleigh

7.5.2.1.4. absorción de fondo

7.5.2.2. especies fluorescente

7.5.2.3. muestra parcialmente soluble