TEMA 7 CLONACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. PROCESO

1.1. Inserción del fragmento de ADN que se requiere amplificar en una molécula portadora o vector.

1.2. Introducción del vector recombinante en una célula viva hospedadora.

1.3. Selección y multiplicación en cultivo de las células que portan el ADN recombinante.

1.4. Recuperación del fragmento amplificado.

2. VENTAJAS

2.1. Permite obtener cantidades ilimitadas de la secuencia de interés.

2.2. Se puede clonar secuencias de ADN de gran tamaño, mucho mayores que las que se pueden amplificar mediante PCR.

2.3. En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo.

2.4. Posibilita la expresión de genes o de secuencias de interés.

3. COMPONENTES DE LA CLONACIÓN

3.1. VECTORES DE CLONACIÓN

3.2. CÉLULAS HOSPEDADORAS

4. FASES DEL PROCESO DE CLONACIÓN

4.1. FASE I: CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE.

4.2. FASE II: INTRODUCCIÓN DEL VECTOR RECOMBINANTE EN LA CÉLULA HOSPEDADORA.

4.3. FASE III: SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LOS CLONES QUE PORTAN LA SECUENCIA DE INTERÉS.

5. CREACIÓN DE UN VECTOR RECOMBINANTE

5.1. 1. PREPARACIÓN DEL ADN QUE SE VA A CLONAR

5.2. 2. PREPARACIÓN DEL VECTOR DE CLONACIÓN

5.3. 3. INSERCIÓN DEL ADN EXTRAÑO EN EL VECTOR.

6. INTRODUCCIÓN DEL VECTOR EN LA CÉLULA HOSPEDADORA

6.1. TRANSFORMACIÓN BACTERIANA

6.2. TRANSFECCIÓN

6.3. TRANSDUCCIÓN

6.4. ELECTROPORACIÓN

7. SELECCIÓN E IDENTIFICACIÓN DE CLONES RECOMBINANTES

7.1. 1. Células no transformadas, que no han captado ninguna molécula de ADN extraño.

7.2. 2. Células transformadas que portan el vector recombinante.

7.3. 3. Células transformadas que portan un vector no recombinante o alguna molécula de ADN no deseada producida durante la ligación.

8. TASA DE TRANSFORMACIÓN

8.1. Mide la eficiencia de la introducción del vector en la célula hospedadora.

9. BIBLIOTECAS DE ADN

9.1. BIBLIOTECAS GENÓMICAS

9.2. BIBLIOTECAS CROMOSÓMICAS

9.3. BIBLIOTECAS DE ADNc

10. ANÁLISIS DE UNA BIBLIOTECA DE ADN.

10.1. 1. IDENTIFICACIÓN DE CLON O CLONES.

10.2. 2. EL PASEO CROMOSÓMICO O IDENTIFICACIÓN DE CLONES QUE PORTEN SECUENCIAS CONSECUTIVAS.

10.3. 3. SECUENCIACIÓN

11. APLICACIONES DE LA CLONACIÓN MOLECULAR

11.1. Clonación en vectores de expresión

11.2. Clonación mediante insercción de genes en el genoma de células vegetales o animales.

11.3. Ratones transgénicos.

11.4. Terapia génica.