Procesos de tratamiento de productos DOWNSTREAM. (1)

1. Downstream

1.1. - extracción de producto, purificación y refinamiento - tratamiento de aguas - recuperación de subproducto

2. Floculación y flotación

2.1. 1.- Floculación y flotación Las células aisladas en el rango de tamaño de 1 a 10 µm sedimentan solo muy lentamente y son difíciles de precipitar incluso con la centrífuga. En estos casos se recurre a la floculación para producir grandes agregados que sedimentan mucho más rápidamente ya que la velocidad de sedimentación de una partícula aumenta con su diámetro (ley de Stokes).

2.1.1. En la mayor parte de los casos se añade un agente floculante como una sal inorgánica, polielectrolitos orgánicos o hidrocoloides minerales. La floculación depende tanto del agente floculante empleado como de otros factores como la naturaleza de las células, de los constituyentes iónicos así como su concentración. La floculación puede ocurrir reversiblemente si las cargas sobre la superficie de la célula pueden neutralizarse por iones de carga opuesta, e irreversiblemente si se forman, entre las células, puentes de moléculas poliméricas cargadas.

3. Filtración.

3.1. Filtración del tampón Los tampones necesarios para el equilibrado, el lavado y la elución durante las etapas de cromatografía necesitan ser filtrados para evitar que las partículas en suspensión bloqueen la matriz cromatográfica. La elección del tamaño del poro del filtro, normalmente, depende del tamaño de las esferas que forman la matriz cromatográfica

3.2. Lo más frecuente es que la primera etapa en el proceso de recuperación se lleve a cabo por algún tipo de proceso de filtración. Los dos principales tipos de filtros son los denominados filtros en profundidad y filtros en superficie; en ambos casos la fuerza motriz es la presión, sea creada por sobrepresión o por vacío.

3.2.1. Un filtro en profundidad se construye a partir de una matriz filamentosa, como lana de vidrio o papel de filtro, llevándose a cabo el proceso de filtración debido a que las partículas que han de ser removidas quedan atrapadas dentro de la matriz. Las partículas que van a ser filtradas son frecuentemente más pequeñas que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a través de los intersticios retorcidos del filtro. Los filtros en superficie son membranas en las que el tamaño de los poros es más pequeño que las partículas que van a ser filtradas. Las partículas son, por consiguiente, separadas sobre las superficies de los filtros.

3.3. Filtración estéril La filtración esterilizante del concentrado final del producto requiere baja unión de proteínas, bajo volumen de retención y filtros validados de 0,2μm para minimizar las pérdidas del producto.

4. Aislamiento final

4.1. La pureza final requerida depende de la aplicación que va a tener el producto y es la que determina la secuencia de procesos necesarios. Una secuencia de operaciones unitarias típica para obtener productos de alta calidad como los productos farmacéuticos, es la que comienza con cristalización y continúa con centrifugación o filtración y secado.

5. Purificación

5.1. Los procesos de purificación son altamente selectivos, ya que logran separar los productos de impurezas que tienen propiedades muy similares. Las operaciones unitarias más utilizadas en esta etapa de Tratamiento de los Productos son la cromatografía, ultrafiltración y precipitación fraccional.

6. Aislamiento primario

6.1. Aunque hay disponible una gran variedad de técnicas disponibles para la separación primaria de los productos extraídos del interior de las células o de los caldos libres de células, el método a utilizar está en dependencia de las propiedades físicas y químicas de los productos y del material que lo acompañe.

7. Los pasos posteriores al cultivo de células o la clarificación del lisado, implican una serie de etapas que incluyen purificación en gel, cromatografía de afinidad, diafiltración, ultrafiltración y filtración estéril del concentrado del producto final.

8. Ruptura celular

8.1. En los casos que los productos de interés están en el interior de las células, se lleva a cabo el proceso de ruptura celular, en la cual se utiliza principalmente las operaciones de homogeneización, molino de bolas y el shock osmótico.

9. Separación de las Células

9.1. Comúnmente la primera etapa en la recuperación del producto de la biorreacción, es la separación de las células del caldo de fermentación. Eso es necesario porque la biomasa en sí puede ser el producto deseado, como por ejemplo la levadura panadera, pero también se requiere cuando el producto deseado está en la fase líquida

10. Extraccion.

10.1. La extracción, cuando se aplica a los bioproductos, tiene tanto la función de separación como la de concentración. El caldo acuoso de fermentación que contiene el producto deseado se mezcla con un solvente inmiscible en el que se disuelva preferentemente y del que pueda ser más fácil y específicamente recuperado. Una vez se ha concentrado el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente purificado. La extracción con solventes ha sido utilizada ampliamente en la industria de antibióticos, como la penicilina, utilizando solventes como el acetato de amilo o de butilo.

11. Métodos físicos

11.1. La desintegración por ultrasonidos se utiliza ampliamente en el laboratorio, pero debido a su alto coste no es adecuada para procesos a escala industrial. Otro método físico incluye repetidos ciclos de congelación y descongelación pero en este caso muchas de las células permanecen intactas.

12. Métodos químicos

12.1. Los métodos químicos utilizados para desintegrar células microbianas incluyen tratamiento con álcalis o ácidos, solventes orgánicos y detergentes.

13. Ruptura celular

13.1. La ruptura celular resulta imprescindible para liberas los productos como las enzimas y las proteínas recombinantes que permanecen dentro de la biomasa

14. Cromatografía

14.1. Algunas de las etapas más caras en la recuperación del producto implican el uso de métodos cromatográficos. Tales métodos son de especial valor para la purificación de materiales biológicos sensibles y encuentran un amplio uso en la preparación de materiales farmacéuticos, reactivos de diagnóstico y reactivos para investigación. Los distintos métodos cromatográficos que existen según su mecanismo de separación son: filtración en gel (peso molecular), cromatografía de adsorción (interacciones hidrofóbicas), cromatografía de intercambio iónico (carga), cromatografía de afinidad (actividad biológica) y electroenfoque (punto isoeléctrico).

15. El procesamiento de un producto después de la fermentación se denomina “downstream processing” (procesamiento descendente )

15.1. Definición: Recuperación, aislamiento, purificación y refinamiento de productos sintetizados por procesos biotecnológicos • Definición extendida: Etapas de refinamiento final de procesos tales como tratamiento de efluentes y purificación de agua por biotecnología.

16. Centrifugación.

16.1. La centrifugación no sólo se utiliza para separar partículas sólidas de la fase líquida sino también para la separación de fluido/fluido. Si bien la separación fluido/partícula es de la mayor importancia, la separación fluido/fluido también es importante como es el caso en la producción de penicilina para la separación del solvente que extrae el antibiótico de la fase acuosa mediante una contracorriente continua en dos etapas con acetato de amilo o de butilo a 0-3°C y pH: 2,5-3,0.

16.2. La separación eficiente de las células por centrifugación se ve favorecida por un tamaño grande de las partículas, una gran diferencia entre la densidad de las partículas y el líquido, una baja viscosidad del líquido, un radio elevado del rotor de la centrífuga y una alta velocidad angular. Tanto el tamaño de las partículas, su densidad así como la viscosidad del líquido normalmente no se pueden controlar. Además, el radio del rotor de la centrífuga no puede incrementarse indefinidamente ya que el estrés mecánico incrementa con el cuadrado del radio por lo que los límites de seguridad se alcanzan fácilmente.

17. Rendimiento

17.1. Las pérdidas en la recuperación dependen de la sensibilidad de las sustancias al proceso y del número de etapas de purificación. El promedio de pérdidas atribuidas a la purificación está en torno al 20% pero en casos extremos, con ciertos tipos de metabolitos intracelulares, puede llegar a ser el 90%. En la transparencia se muestran los datos para la purificación de ácido glutámico donde se observa la extensión en la que deben ser combinados y optimizados los métodos de recuperación. El rendimiento final es sólamente un factor, ya que el coste de los productos químicos, el equipo y los salarios deben ser considerados en el cálculo global.

18. UPSTREAM

18.1. - formulación de medios - desarrollo de inóculo - esterilización - inoculación

19. Métodos biológicos

19.1. Se utiliza la lisis enzimática. Por ejemplo, la pared celular de las bacterias Gram + se hidroliza con el enzima lisozima que se aisla de la clara de huevo. La pared celular de las bacterias Gram - se hidroliza con lisozima y EDTA. La pared celular de las levaduras se hidroliza con una combinación de uno o más de los enzimas b (1,3)-glucanasa, b (1,6)-glucanasa, mananasa y quitinasa.

20. Cristalización y precipitación

20.1. La cristalización a baja temperatura es una forma muy suave de purificación. La cristalización se utiliza principalmente para la purificación de compuestos de bajo peso molecular, como los antibióticos. Por ejemplo, la Penicilina G es generalmente extraída del caldo de fermentación con acetato de butilo y cristalizada por adición de acetato potásico en solución etanólica.

21. Desecación

21.1. El secado del material biológico es en muchos casos el método final por el que los productos son llevados a una forma estable adecuada para su manejo y almacenamiento. La sensibilidad al calor de la mayor parte de los productos biológicos significa que los únicos métodos que pueden ser utilizados son los que conducen a la eliminación de agua con elevación mínima de la temperatura. En algunos casos, la termoestabilidad de los productos, como enzimas o preparaciones farmacéuticas, es mejorada por la adición de azúcares u otros estabilizantes inertes.

21.2. La liofilización es el método de desecación más suave debido a que el agua es sublimada a partir de una masa congelada. Muchos productos farmacéuticos son liofilizados como vacunas, fracciones de plasma, hormonas y preparaciones de enzimas, así como ingredientes muy lábiles y caros para diagnosis. También se utiliza la liofilización cuando el producto final es un cultivo microbiano vivo (cultivos para inoculación en las industrias lácteas).

22. R. Roberto Gonzalez-Castellanos. (2018). Introducción a los Bioprocesos. 15de Junio del 2021, de Archivo local o compartido Sitio web: file:///C:/Users/Usuario/Downloads/Introducci%C3%B3n%20a%20Bioprocesos%20(act.%2009-06-2018)%20(1).pdf

23. Elaboro: Felipe de Jesus Fernandez Suarez.