1. RECEPCIÓN DE MUESTRAS
1.1. Recoger muestras con material estéril.
1.1.1. Transporte en recipiente estéril, humificado y a prueba de vertidos.
1.1.1.1. No añadir conservantes.
1.1.1.1.1. Siembra en máximo de 2 horas tras la obtención.
2. PREPARACIÓN DE MUESTRAS
2.1. Observación macroscópica.
2.2. Observación microscópica.
2.2.1. Trocear tejido.
2.2.1.1. Fragmentos unguales se trocean progresivamente.
2.2.1.1.1. Fluidificación de muestras viscosas.
3. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA.
3.1. EXAMEN EN FRESCO.
3.1.1. En muestras de **piel y material ungueal** .
3.1.1.1. Poca cantidad de muestra + gota de KOH al 10%.
3.2. TINCIONES.
3.2.1. MUESTRA DE TEJIDOS.
3.2.1.1. **Tinciones histológicas**
3.2.1.1.1. Giemsa+eosina.
3.2.1.1.2. PAS.
3.2.1.1.3. Argénicas.
3.2.1.1.4. Inmunofluorescenia.
3.2.2. MUESTRAS LÍQUIDAS.
3.2.2.1. Tinción de tinta china o nigrosina.
4. CULTIVO DE MUESTRAS
4.1. MEDIOS DE CULTIVO PARA AISLAMIENTO.
4.1.1. SDA sin antimicrobianos.
4.1.1.1. Agar glucosado de Sabouraud.
4.1.2. SDA con antimicrobianos.
4.1.2.1. Agar dextrosa Sabouraud + antimicrobianos.
4.1.3. Medio con ciclohemida.
4.1.3.1. Inhibe muchos hongos contaminantes.
4.1.4. BHIA.
4.1.4.1. Para aislamiento de patógenos.
4.2. MEDIOS DE CULTIVO PARA LA IDENTIFICACIÓN.
4.2.1. **Agar urea de Christensen**
4.2.1.1. Identificación de dermatofitos.
4.2.2. **CMA con Tween 80**
4.2.2.1. Cultivo y diferenciación de Candida.
4.2.3. **MEA**
4.2.3.1. Aislamiento y recuento de levaduras. Identificación de *Aspergilus, Penicilium*
4.2.4. **MYCA**
4.2.4.1. Aislamiento de hongos patógenos. *Candida no albicans, Aspergilus o Cryptococcus neoformans*
4.3. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
4.3.1. Adicción de antibióticos después de esterilización del medio (ALGUNOS)
4.3.1.1. Cultivo en Placa de Petri.
4.4. INCUBACIÓN.
4.4.1. Temperatura óptima de crecimiento de mayoría de hongos patógenos: **30ºC**
4.4.1.1. Para hongos dimórficos y en micosis profundas: **37ºC**
4.4.1.1.1. Los cultivos no se desechan cuando se aísla un hongo, sino que debe completarse el periodo de incubación (3-4 semanas)
5. IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS.
5.1. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE CRITERIOS MORFOLÓGICOS.
5.1.1. OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA.
5.1.1.1. Cultivo SDA
5.1.1.1.1. Colonias planas/convexas.
5.1.2. OBSERCACIÓN MICROSCÓPICA.
5.1.2.1. VISUALIZACIÓN DE HIFAS Y ESPORAS.
5.1.2.1.1. Permite la identificación definitiva o presuntiva de algunas especies de levaduras.
5.1.2.2. PRUEBA DEL TUBO GERMINAL O DE FILAMENTACIÓN PRECOZ.
5.1.2.2.1. Extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en su origen. Su anchura suele ser la mitad de la que tiene la célula y su longitud, 3 o 4 veces mayor.
5.2. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE CRITERIOS BIOQUÍMICOS.
5.2.1. PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DE CANDIDA.
5.2.1.1. MEDIOS CROMOGÉNICOS.
5.2.1.1.1. Formación de colonias de un color u otro según su actividad enzimática.
5.2.1.2. MEDIOS FLUOROGÉNICOS.
5.2.1.2.1. Incorporación de un componente en el medio que produce un metabolismo fluorescente.
5.2.1.3. SISTEMAS RÁPIDOS DE IDENTIFICACIÓN.
5.2.1.3.1. **BactiCard Candida**
5.2.2. PRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CRYPTOCOCCUS.
5.2.2.1. Hongo que provoca infecciones pulmonares y meníngeas. Visible al microscopio mediante una tinción con tinta china.
5.2.2.1.1. Para **confirmación de diagnóstico**
5.2.3. IDENTIFICACIÓN BASADA EN MÉTODOS DE ASIMILACIÓN DE NUTRIENTES: AUXONOGRAMA.
5.2.3.1. Prueba para determinar la capacidad de una levadura para asimilar diferentes nutrientes presentes en el medio de cultivo.
5.2.4. SISTEMAS DE IDENTIFICACIÓN RÁPIDA.
5.2.4.1. Galerias cuyo procedimiento consta de 3 fases:
5.2.4.1.1. INOCULACIÓN DE LA GALERÍA.
5.2.4.1.2. INCUBACIÓN A TEMPERATURA Y TIEMPO RECOMENDADOS.
5.2.4.1.3. LECTURA DE GALERÍA.
5.3. IDENTIFICACIÓN MEDIANTE CRITERIOS PROTEÓMICOS.
5.3.1. TÉCNICA MALDI-TOF.