TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS Y REACCIONES COLORIMÉTRICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE AMINOÁCIDOS

1. Colocar los cromatofolios secos en la campana de extracción y rociarlos uniformemente con la disolución de ninhidrina 0.2 %.

2. Aplicación de los estándares y muestras

2.1. Para los cromatofolios 1 y 2, aplicar 1 μL de los estándares de aminoácidos y secar con el soplador caliente

2.2. En el último punto, colocar 3 μL de la muestra, en aplicaciones de 1 μL, secando después de cada aplicación

2.3. Para el cromatofolio 3, aplicar 1 μL de los estándares de aminoácidos en el punto de aplicación y secar inmediatamente con el soplador

2.4. Para el cromatofolio 4, colocar 3 μL de la muestra, en aplicaciones de 1 μL, secando después de cada aplicación.

2.5. Neutralizar los cromatofolios a vapores de amoniaco durante 15 – 30 segundos. Realiza esta operación en la campana de extracción de gases

3. Desarrollo de cromatofolios

3.1. Colocar los cromatofolios 1, 3 y 4 en la cámara de saturación que contenga la mezcla cloroformo-metanol-amoniaco 17 % (2:2:1) hasta aproximadamente 1 cm del extremo opuesto.

3.2. Retirar los cromatofolios de la cámara de saturación y marcar el frente del disolvente y secar los cromatofolios utilizando el soplador de aire caliente

3.3. Colocar los cromatofolios 2, 3 y 4 en la cámara de saturación que contenga la mezcla metanol-etanol-agua-urea (9:9:2:0.06 g de urea) y desarrollar hasta, aproximadamente, 1 cm del extremo opuesto.

3.3.1. Cuidar que los cromatofolios 3,4 se desarrollen en una línea de aplicación distinta

3.4. Retirar los cromatofolios de la cámara de saturación y marcar el frente del disolvente

3.5. Secar los cromatofolios utilizando el soplador de aire caliente.

4. Revelado de cromatofolios

4.1. Revelar por calentamiento hasta que manchas de color púrpura sean visibles.

5. Preparación de la muestra

5.1. En caso de contar con una muestra que presente partículas sólidas o semi-sólidas, filtrar por papel Whatmann y, posteriormente, centrifugar a 2000 RPM por 10 minutos.

6. Preparación de los cromatofolios

6.1. Medir, y marcar con lápiz, un cromatofolio de 20 x 20 cm en segmentos de 10 cm. o Cortar por medio de navaja o cutter en 4 partes para obtener 4 cromatomafolios de 10x10

6.2. Numerar del 1 al 4, en una esquina y con lápiz, cada uno de los cromatofolios de 10 x 10 cm

6.3. A los cromatofolios numerados como 1 y 2. trazar la línea de aplicación a 1 cm de un solo extremo del cromatofolio, con lápiz. Sobre esta línea, y espaciados a 1 cm entre cada uno, marcar los puntos para aplicación de los estándares de aminoácidos y de la muestra.

6.3.1. Indicar debajo de la línea y para cada punto la nomenclatura del aminoácido estándar que se utilizará, así como del punto correspondiente a la muestra.

6.3.2. A los cromatofolios 3 y 4, trazar dos líneas de aplicación a 1 cm de extremos perpendiculares del cromatofolio, con lápiz. Marcar el punto para aplicación, que será el cruce de las líneas de aplicación.