AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

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AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS por Mind Map: AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE ENZIMAS

1. Métodos de aislamiento

1.1. Molienda con abrasivos

1.1.1. Ruptura de la pared celular por tensión y corte (mortero y pistilo).

1.2. Congelación y descongelación

1.2.1. La congelación causa una tensión en la membrana celular (ruptura) y la descongelación causa la fusión del hielo (homogenato crudo).

1.3. Largos períodos de mezclado

1.3.1. Se rompe por la colisión entre las paredes del mezclador .

1.4. Adición de perlas de vidrio durante el mezclado

1.4.1. Amentar el esfuerzo mecánico.

1.5. Enzimas hidrolíticas

1.5.1. Las proteasas y lipasas forman poros o huecos, donde las células y organelos rotos pueden ser puestos en solución.

1.6. Homogenización ( Homogenizador Potter- Elvenhjem)

1.6.1. El tejido al ser homogenizado es picado y mezclado (solución isotónica).

1.7. Soluciones hipotónicas

1.7.1. Las células se revientan por la absorción de agua (hinchazón).

1.8. Vibraciones ultrasónicas

1.8.1. Alteración de la células y formación de un homogenato

1.9. Alteración del pH de la solución

1.9.1. Causa la coagulación de las proteínas, formando poros , por donde las células rotas exudan un homogenato.

1.10. Solventes orgánicos

1.10.1. Se emplean para disolver los lipídicos conduciendo a la formación de poros.

2. Métodos de purificación

2.1. Por el tamaño o masa

2.1.1. Centrifugación

2.1.1.1. Se utiliza en moléculas grandes y pequeñas

2.1.1.2. Remueve los restos celulares después de la homogenización

2.1.1.3. La centrifugacion zonal

2.1.1.3.1. Separa no solo proteínas, macromoléculas sino también organelos y virus.

2.1.2. Filtración en gel

2.1.2.1. Se utiliza en moléculas pequeñas

2.1.2.2. Es un metodo de separación dependiente del tamaño molecular

2.1.2.3. Características del gel

2.1.2.3.1. Debe ser químicamente inerte

2.1.2.3.2. Debe tener un número pequeño de grupos iónicos

2.1.2.3.3. Debe tener poro y el tamaño de la partícula uniformes.

2.1.2.3.4. Alta rigidez mecánica

2.1.2.4. Los geles más usados son:

2.1.2.4.1. Dextranos entrecruzados (Sephadex)

2.1.2.4.2. Geles poliacrilamida

2.1.2.4.3. Geles de agarosa

2.1.2.4.4. Styragel

2.1.2.4.5. Perlas de vidrio de poro controlado

2.1.3. Diálisis o ultrafiltración

2.1.3.1. La membrana de diálisis (celofán) se usa para separar proteínas globulares o moléculas (200000) Da.

2.1.3.2. El método es usado para separar pequeñas moléculas orgánicas, sales y solventes orgánicos de los extractos crudos.

2.1.3.3. En la ultrafiltración las pequeñas moléculas e iones pasan por la membrana de diálisis bajo la influencia de presión

2.2. Por la carga

2.2.1. Cromatografía de intercambio iónico

2.2.1.1. Moléculas grandes y pequeñas

2.2.1.2. Intercambio reversible de iones en solución, con iones enlazados a un medio de soporte inerte.

2.2.1.3. Es útil en la separación de compuestos cargados y no cargados.

2.2.2. Electroforesis

2.2.2.1. Moléculas pequeñas

2.2.2.2. Es la migración de moléculas cargadas en un medio

2.2.2.3. La movilidad electroforética se afecta por:

2.2.2.3.1. Carga: A mayor carga, más grande es la movilidad

2.2.2.3.2. Tamaño: Las partículas grandes se mueven más lentamente que las pequeñas

2.2.2.3.3. Forma: Los contornos redondos generan menor retardo friccional

2.2.2.4. Electroforesis de zona

2.2.2.4.1. En la separación, las moléculas son inmovilizadas mediante fijación en diferentes zonas y son detectadas tiñiendolas

2.2.2.4.2. Métodos para detectar las moléculas separadas

2.2.3. Enfoque isoeléctrico

2.2.3.1. Tiene un alto poder de resolución y resuelve en al menos 40 bandas

2.2.3.2. El pH se incrementa gradualmente del ánodo al cátodo

2.2.3.3. El electroenfoque se realiza por tres vías

2.2.3.3.1. Gradiente de densidad

2.2.3.3.2. Geles

2.2.3.3.3. Electroenfoque de convección de zona

2.3. Por el cambio de solubilidad

2.3.1. Cambio de pH

2.3.1.1. El ajuste del pH se usa para precipitar la enzima

2.3.2. Cambio en fuerza iónica

2.3.2.1. A altas concentraciones de sal, la concentración de agua se reduce

2.3.2.1.1. Disminuyendo las interacciones soluto-solvente y la solubilidad de las proteínas

2.3.3. Disminución en la constante dieléctrica

2.3.3.1. Al añadir solventes solubles en agua disminuirá la constante dieléctrica e incrementará las fuerzas electrostáticas

2.4. Por sitios de enlazamiento específico

2.4.1. Cromatografía de afinidad

2.4.1.1. Enlazamiento específico no covalente de las enzimas con moléculas( ligandos)

2.4.2. Elución de afinidad

2.4.2.1. Es más ventajosa que la cromatografía de afinidad

2.4.2.1.1. Reacciones complejas de enlazamiento

2.4.2.1.2. Las columnas son más baratas

2.4.3. DESVENTAJAS

2.4.3.1. Las técnicas son costosas

2.4.3.2. No se podrían usar en las fases iniciales de purificación

2.4.4. SOLUCIÓN A LAS DESVENTAJAS

2.4.4.1. Ultrafiltración de afinidad de flujo cruzado

2.4.4.1.1. Usan membranas microporosas con un tamaño de poro de 3-5 mm

2.4.4.2. Precipitación de afinidad

2.4.4.2.1. Usa polímeros que son solubles bajo condiciones particulares

2.4.4.3. Separaciones de afinidad sin matriz

2.4.4.3.1. No requiere ligando o matriz

2.5. Otro métodos de purificación

2.5.1. Precipitación fraccional mediante el calor

2.5.1.1. Eliminar la contaminación no deseada de la proteína

2.5.1.2. Es útil como primera etapa en la purificación

2.5.1.3. El tiempo de calentamiento está entre 10 a 15 min.

2.5.2. Adsorción fraccional en geles de fosfato de calcio

2.5.2.1. Los principales adsorbentes incluyen gel de fosfato de calcio y gel de alúmina

2.5.3. Métodos adicionales

2.5.3.1. Cromatografía en hidroxiapatita

2.5.3.2. Cromatografía hidrofóbica

2.5.3.3. Concentración por liofilización

2.5.3.4. Las sales de metales pesados

2.5.3.4.1. Dan como resultado la precipitación y formación de cristales

3. Elección de los metodos de purificacion

3.1. El volumen del extracto crudo

3.1.1. Cuando una enzima es aislada y purificada el volumen inicial del homogenato es grande

3.2. La instrumentación requerida

3.2.1. Métodos de fraccionamiento

3.2.1.1. La instrumentación es simple y de bajo costo

3.3. El período de tiempo disponible

3.3.1. Técnicas por afinidad sin matriz son y métodos de salado son rápidas

3.4. La económica del proceso involucrado

3.5. La pureza requerida

3.5.1. La enzima aislada necesita ser ultra pura, para investigación, diagnóstico y administraciones terapéuticas

4. Términos relacionados con la purificacion

4.1. Rendimiento = unidades de actividad enzimática en la fracción/ unidades de enzima en el extracto crudo

4.2. Actividad específica = Unidades de actividad de la enzima en solución/ Contenido total de proteína en la fracción

4.3. Factor de purificación= Actividad específica de la fracción / Actividad específica del extracto crudo

5. Desarrollo de enzayos

5.1. Ensayos cualitativos

5.1.1. Se usan para determinar que la enzima de interés está presente en la fuente escogida para aislarla.

5.2. Ensayos cuantitativos

5.2.1. Se usa para medir la actividad de la enzima y el grado de purificación

5.2.2. Ensayo de dos puntos

5.2.2.1. Se realiza después del final del tiempo de reacción específico.

5.2.3. Ensayo cinético

5.2.3.1. Al disminuir la concentración de sustrato , la velocidad de reacción también decrece

6. Estabilización y cristalización de enzimas

6.1. Estabilización

6.1.1. Condiciones de pH, fuerza iónica, composición aniónica/catiónica

6.1.2. Para almacenamiento a largo plazo, se debe mantener a temperaturas criogénicas de alrededor de -70 °C

6.1.3. Pueden desnaturalizarse y perder la actividad de la enzima

6.2. Cristalización

6.2.1. Ventajas de los cristales de enzima

6.2.1.1. Pueden ser fácilmente empacados, almacenados y transportados

6.2.1.2. Menor opción de ataque microbiano y cambios espontáneos.

6.2.1.3. Se utiliza en microcantidades.

6.2.1.4. Se pueden usar para estudios cristalográficos

7. Métodos de preservación de las enzimas purificadas

7.1. La técnica más efectiva es la criogénica

7.2. Precauciones para el almacenamiento

7.2.1. El almacenamiento debe ser en microalícuotas

7.2.2. Evitar los materiales de vidrio y plástico

7.2.3. La preparación debe ser microfiltrada

7.2.4. Se recomiendan con frecuencia estabilizantes

8. Propiedades generales de las enzimas

8.1. Son sintetizadas en las células

8.2. Funcionan como catalizadores

8.3. En su mayoría son universales

8.4. Son principalmente proteínas por naturaleza

8.5. También son activas en sistemas libres de células

8.6. Catalizan reacciones disminuyendo la energía de activación

8.7. Son altamente sensibles a parámetros ambientales

8.8. Pueden ser sintetizadas en formas precursoras

8.9. Pueden ser dependientes de coenzima/cofactor

8.10. Muchas enzimas son alostéricas en naturaleza

8.11. Pueden mostrar preferencias direccionales mientras catalizan reacciones reversibles

8.12. Pueden reusarse efectivamente en sistemas libres de células

8.13. Las enzimas son a veces mejores herramientas que al usar las células microbianas completas