1. DEFINICIÓN
1.1. Es el proceso de determinación de la secuencia de nucleótidos que componen una molécula de ADN o de ARN y que se representa por las iniciales de las bases nitrogenadas que portan.
2. MÉTODO DE MAXAM Y GILBERT
2.1. Se basa en la modificación de las bases nitrogenadas mediante reacciones químicas específicas.
2.2. PROTOCOLO
2.2.1. 1. Marcaje de uno de los extremos de la molécula con el isótopo radioactivo 32P.
2.2.2. 2. Reaccione de modificación química de bases nitrogenadas.
2.2.3. 3. Electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución.
2.2.4. 4. Autorradiografía del gel
2.2.5. 5. Análisis de la autorradiografía
3. MÉTODOS ENZIMÁTICOS DE TERMINACIÓN DE CADENA
3.1. Son métodos enzimáticos basados en reacciones de polimerización de cadenas complementarias a la que se quiere secuenciar.
3.2. MÉTODO DE SANGER
3.2.1. FASES
3.2.1.1. 1. Reacciones de polimerización
3.2.1.2. 2. Electroforesis en gel
3.2.1.3. 3. Autorradiografía
3.2.1.4. 4. Análisis de los resultados
3.2.2. VARIACIONES DEL MÉTODO DE SANGER
3.2.2.1. Utilización de marcadores fluorescentes.
4. SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE 1º GENERACIÓN
4.1. Se basa en el método enzimático de terminación de cadena de Sanger y en el uso de cuatro fluoróforos como marcadores.
4.2. REACCIONES DE POLIMERIZACIÓN. PCR
4.2.1. El proceso que va a limitar la eficiencia del método de Sanger son las reacciones de polimerización.
4.2.2. VENTAJAS
4.2.2.1. Se requiere mucha menor cantidad de ADN que se pretende secuenciar.
4.2.2.2. Se puede secuenciar a partir de una mezcla compleja de moléculas de ADN bicatenarias.
4.2.3. SE PODRÍA REALIZAR 2 PCR CONSECUTIVAS:
4.2.3.1. PCR convencional de amplificación
4.2.3.2. PCR de secuenciación (2 tipos)
4.2.3.2.1. Secuenciación con cebador fluorescente
4.2.3.2.2. Secuenciación por terminador fluorescente
4.2.4. FASES AUTOMATIZADAS EN SECUENCIADOR
4.2.4.1. Electroforesis
4.2.4.2. Detección
4.2.4.3. Interpretación de los resultados
4.3. SECUENCIACIÓN A GRAN ESCALA
4.3.1. Persigue secuenciar fragmentos mucho mayores a las 1000 bases e incluso genómas enteros.
5. SECUENCIACIÓN DE 2º GENERACIÓN
5.1. FASE DE PREPARACIÓN DEL ADN MOLDE
5.1.1. Amplificación clonal del ADN molde
5.1.1.1. PCR en emulsión
5.1.1.2. PCR en fase sólida o PCR puente
5.1.2. REACCIONES DE SECUENCIACIÓN
5.1.2.1. Terminación reversible cíclica
5.1.2.1.1. Se basa en la utilización de dNTP marcados con un fluoróforo y bloqueados para impedir que se puedan unir más nucleótidos, por lo que actúan como terminadores de cadena.
5.1.2.2. Pirosecuenciación
5.1.2.2.1. Se basa en la producción de bioluminiscencia mediante reacciones enzimáticas acopladas a la incorporación de un nucleótido a una cadena en crecimiento.
6. SECUENCIACIÓN DE 3º GENERACIÓN
6.1. SECUENCIACIÓN ION TORRENT
6.2. SECUENCIACIÓN POR NANOPOROS
7. SECUENCIACIÓN DE ARN
7.1. Métodos enzimáticos directos de secuenciación de ARN
7.1.1. Son métodos de terminación de cadena al igual que el método de Sanger para secuenciar el ADN.
7.2. Métodos indirectos de secuenciación de ARN
7.2.1. Se basan en la obtención previa de un ADNc mediante transcripción inversa.