1. UV-V
1.1. FUNDAMENTO: se basa en el análisis de la cantidad de radiación electromagnética, en el rango de longitud de onda UV-V que puede absorber o transmitir una muestra en función a la cantidad de sustancia presente. . La espectroscopia molecular comprende las regiones ultravioleta (UV) y visible del espectro; el rango del ultravioleta cercano es de 190 a 380 nm mientras que el rango visible se considera de los 380 a los 750 nm.
1.2. Procedimientos
1.2.1. Barrido espectral
1.2.1.1. a) Encender el espectrofotómetro y esperar que se estabilice. b) Seleccionar el rango de longitud de onda de trabajo c) Colocar en la cubeta el blanco (una disolución que contiene todos los reactivos utilizados para disolver la sustancia de interés y que no contenga el compuesto a determinar). Limpiar externamente la cubeta y colocarla en el espectrofotómetro. d) Ajustar la absorbancia a cero. e) Seleccionar una de las soluciones de permanganato de potasio y llenar una cubeta, la cual debe estar limpia y seca. f) Colocar la cubeta en el espectrofotómetro y realizar el barrido espectral.
1.2.2. Lectura de absorbancia
1.2.2.1. a)Encender el espectrofotómetro y permitir que se estabilice. b) Seleccionar la longitud de onda de máxima absorción para el compuesto a determinar. c) Calibrar a cero el equipo con la solución blanco (una disolución que contiene todos los reactivos utilizados para disolver la sustancia de interés y que no contenga el compuesto a determinar). d) Realizar la medición de la absorbancia para cada solución del compuesto a determinar y para la solución de concentración desconocida y anotarla en una tabla. e) Realizar la curva de calibración para el compuesto a determinar y calcular la concentración en la muestra problema.
1.3. Aplicaciones
1.3.1. • Cuantificación de macro componentes (el contenido total de hidratos de carbono) • Estimaciones de enranciamiento (estado de oxidación de los lípidos) • Determinación de pigmentos (basada en su absorción de radiación en la zona del visible) • Determinación de impurezas en muestras orgánicas, enzimas de glucosa en vinos, vitaminas. • Análisis de contenido de proteínas solubles • Determinación de nitritos en jamón de York y aguas, hierro en vinos y fosfato en bebidas. NOTA: en las ultimas dos, análisis de contenido de proteínas solubles y determinación de nitritos en jamón de york y agua, son especies que no absorben en el visible: mediante su reacción previa con reactivos adecuados para dar un compuesto coloreado
1.4. Precauciones
1.4.1. Antes de usar el equipo
1.4.1.1. - Limpieza de la superficie del instrumento. Limpieza d e los filtros y fuente de luz (lámpara y condensador). Verificar instalaciones eléctricas
1.4.2. Probar operatividad del equipo
1.4.2.1. a) Encender el equipo y dejarlo calentar. b) Se selecciona la longitud de onda deseada c) Se selecciona la función absorbancia o transmitancia. d) Se ajusta el aparato a cero con agua destilada. Si el aparato que se va a utilizar tiene las dos escalas (absorbancia y transmitancia) se ajustan las lecturas a cero de absorbancia y 100% de transmitancia utilizando los controles grueso y fino en vacío. e) Se lee un estándar de concentración conocida y se ajusta el aparato a esa concentración. Si el aparato que se va a utilizar no tiene control estándar,este se utiliza para obtener el factor de calibración, dividiendo la concentración del estándar entre su lectura
1.4.3. Uso y cuidados del equipo
1.4.3.1. a) Coloque el instrumento en un lugar en donde no esté sujeto a vibraciones, calor excesivo, humedad o luz directa. b) Proteja el instrumento del polvo. No tocar las superficies ópticas tales como lentes y filtros. c) Permitir que el instrumento se caliente antes de hacer algún procedimiento. d) Verificar el 0 y el 100% T cada vez que se vaya a hacer lecturas y cuando se varíe la longitud de onda. e) Asegúrese de que las cubetas estén limpias y libres de ralladuras y huellas digitales
2. IR
2.1. FUNDAMENTO: Se basa en el análisis de la radiación electromagnética, en el rango de onda Infrarroja que puede absorber o transmitir una muestra en función de la cantidad de sustancia presente. La radiacion electromagnetica de esta region corresponde a una longitud de onda de 780nm a 1mm. en la absorción de energía de radiación infrarroja por los enlaces de una molécula, generando en ésta deformaciones y dando como resultado transiciones de energía vibracional en lugar de transiciones electrónicas (las cuales se producían al absorber energía en el espectro uv-vis). Una molécula absorberá la energía de un haz de luz infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria para que se produzca una deformación producto de una transición vibraciona
2.2. Procedimiento
2.2.1. a) Hay que instalar previamente el divisor de haz (KBr), se sella el instrumento para evitar señales procedentes de vapor de agua y dióxido de carbono. La sensibilidad del detector aumenta considerablemente al bajar la temperatura por eso se vierte nitrógeno líquido que mantiene el elemento sensible a una temperatura de 77K (temperatura a la cual el detector da una señal suficientemente intensa incluso en radiaciones muy débiles ) b) Una vez introducida la muestra se sella el compartimento de muestras para hacer vacío y trabajar a presiones muy bajas. c)Se obtiene una serie de interferogramas, a partir de ellos se obtiene espectros haciendo la transformación de furier, dichos espectros se promedian para dar un espectro señal/ruido mas preciso.
2.2.2. celdas
2.2.2.1. • Celda para líquidos: armadura metálica que tiene dos ventanas de un material (transparente IR) que no es sensible a la muestra. Se llena con una jeringa. La radiación atraviesa las ventanas, llega al compartimiento de la muestra, ésta absorbe radiación, atraviesa la otra ventana y llega al detector. La celda se inserta primero en un soporte cilíndrico y después en el compartimento de muestras. • Celda para sólidos: la muestra es una pastilla de KBr que contiene la muestra y va alojada en la parte central del porta muestras. Muestra: dispersión en KBr, éste seco se vierte en mortero de ágata sobre la muestra y se tritura hasta conseguir una muestra homogénea. La muestra se vierte en una matriz entre dos pistones para presionar en una prensa todo junto y así obtener la pastilla. • Celda para gases: cilindro de vidrio o metálico que lleva dos ventanas transparentes para IR. Se insertan las dos ventanas entre los extremos del cilindro y se sellan. Después tenemos dos válvulas de entrada de gases. Se instala en una línea de vacío y luego se va introduciendo el gas a determinar su espectro. Se cierran las llaves de paso. Además tenemos una celda para gases para trabajar con distintas temperaturas donde variamos la intensidad de corriente a través de las resistencias. Tiene una válvula de entrada y un termopar (para medir la temperatura interior) Por ultimo tenemos una celda de largo recorrido en la cual gases sobre todo a baja presión dan intensidades a veces débiles y la manera de poder detectar gases en pequeña proporción. Se hace pasar el haz IR por la celda repetidas veces.
2.3. Aplicaciones
2.3.1. • Identificación y determinación de sustancias orgánicas • Identificación de grupos funcionales • Determinación de compuestos responsables del olor y sabor de los alimentos • Distinguir disolvente usado en pinturas • Caracterizar sustancias puras, mezclas de compuestos • Caracterización de polímeros • Determinar humedad en cereales
2.4. Precauciones
2.4.1. Se toman las mismas medidas que en radiacion UV-V