1. TRANSFECCIÓN
1.1. Liposomas químicos: Reactivo Lipofectamine 2000 (ver imágen 2)
1.1.1. Mediante lípidos catiónicos se forman liposomas, estos se encargan de absorber ácidos nucleicos.
1.1.2. La carga positiva de los liposomas y la carga negativa de los ácidos nucleicos permiten que los dos formen un complejo
1.1.3. Estos complejos ingresan a la célula por endocitosis
2. SELECCIÓN
2.1. Crecimiento en bacterias
2.1.1. Resistencia a Ampicilina
2.2. Crecimiento en eucariotas
2.2.1. G418
2.2.1.1. Resistencia a Neomicina fosfotransferasa
3. LÍNEA CELULAR
3.1. Células CHO-K1
3.1.1. Obtenidas de Thermo Fisher, un proveedor de confianza
3.2. Cultivo celular en suspensión
3.2.1. Medio líquido, filtrado estéril, testeado para endotoxinas: F-12 Ham
3.2.1.1. Mezcla de nutrientes (Sigma N6658) con L-glutamina, bicarbonato de sodio, piruvato de sodio, rojo fenol.
3.2.2. Cultivado con antibióticos para evitar contaminaciones
3.2.2.1. Penicilina y estreptomicina
3.2.3. Antibióticos para selección (ver sección de selección)
3.2.4. Medio con antiaglomerante
3.2.4.1. Gibco 01-0057AE
4. CLONACIÓN
4.1. Método Enzimas de restricción
4.1.1. Las enzimas de restricción cortan la secuencia y la ADN ligasa une los intrones, de esta manera se eliminan los exones
5. VECTOR
5.1. Tipo plasmídico: Plásmido recombinante pcDNA3
5.1.1. Contiene orígen de replicación bacteriano y eucariota
5.1.1.1. Permite evaluar la expresión de la cadena en E. Coli en menor tiempo y con menor gasto asociado
5.1.2. Polylinker
5.1.3. Promotores: CMV
5.1.3.1. Fuertes
5.1.3.1.1. Para la secuencia del gen a clonar
5.1.3.1.2. Para el marcador de selección
5.1.4. Secuencias de terminación de la transcripción
5.1.5. Señales de poliadenilación
5.2. El plásmido contiene secuencias de pBR322 que permiten la supervivencia en procariotas y de SV40 que permiten la supervivencia en eucariotas. (ver imágen 1)
5.3. Transmisión estable
6. ADN
6.1. Diseño de la secuencia según bases de datos
6.1.1. GeneBank
6.2. Diseño de primers
6.2.1. 5': CMV-F.
6.2.2. 3': BGH-rev
6.3. Replicación de la secuencia por medio de PCR
7. EVALUACIÓN
7.1. Clonación correcta del ADN
7.1.1. Southern Blot
7.2. Correcta expresión del plásmido
7.2.1. Células procariotas
7.2.1.1. Contacto con ampicilina, se contarán como exitosas las colonias sobrevivientes transfectadas
7.2.2. Células eucariotas
7.2.2.1. Contacto con Neomicina fototransferasa, se contarán como exitosas las células sobrevivientes, estas serán las que se utilizarán en la clonación.
7.3. Correcta expresión de las proteínas
7.3.1. Electroforesis de proteínas SDS-PAGE
7.4. Evaluación de la proteína expresada
7.4.1. SDS-PAGE
7.4.2. HPLC
7.4.3. Ensayo de actividad de la proteína
7.4.3.1. Medición de proliferación inducible mediada por hEPO de células de eritroleucemia humana TF-1