1. ohne Ligand nicht einsetzbar
2. Vorteile: > wenig zeitaufwendige Technik zur Analyse von PCR-Produkten > Gel ist leicht gießbar und denaturiert nicht in den Proben Nachteile: > Gel kann während Elektrophorese schmelzen, Puffer erschöpft, Genmaterial läuft nicht immer gleich (schnell)
3. Als allgemeines Prinzip nutzt jede Chromatographie die Unterschiede in der Verteilung des Analyten auf eine mobile und eine Stationäre Phase
4. > Trennung nach Ladung und Form/Größe im elektrischen Feld > poröses Gel in ionischer Pufferlsg. > Proteinfaltung bleibt erhalten > !Handhabung und Analyse schwierig! > keine Trennung nach Masse, nur IEP und hydrodyn. Volumen
5. Isoelektrische Fokussierung
6. Eine verbleibende Nettoladung auf der Proteinoberfläche verursacht eine elektrostatische Abstoßung der Proteine in Lösung. Zur Aggregation muss diese Abstoßung überwunden werden. Die Barriere kann durch eine Verschiebung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt (pI-Wert) eines Proteins verringert werden. Fast alle Proteine weisen bei ihrem pI-Wert die geringste Löslichkeit auf, und in vielen Fällen kann eine Fällung beobachtet werden. Es gibt aber auch Proteine, die an diesem Punkt gut löslich sind, z.B. die Albumine.
7. Trennverfahren bei der Reinigung von Proteinen. Proteine liegen nur in Lösung vor, wenn sie über eine ausreichende Hydrathülle verfügen. Wenn Salze zugesetzt werden binden die Ionen Wassermoleküle in ihrer Hydrathülle und entziehen sie den Proteinmolekülen. Geschwindigkeit abhängig von Salz und Protein.
8. Osmose durch semipermeable Membran: Abtrennung niedermolekularer Substanzen
9. Proteine können mit kaltem Aceton oder kurzkettigen Alkoholen (Ethanol) gefällt werden. Längerkettige würden durch die entstehende Phasengrenzfläche denaturierend auf Proteine wirken. Welches Lösungsmittel sich am besten für die Fällung eines spezifischen Proteins eignet, muss durch das Experiment geklärt werden. Das Lösungsmittel sollte langsam zudosiert werden, um hohe lokale Konzentrationen zu vermeiden, was eine Denaturierung zur Folge haben kann – aber nicht muss. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation pelletiert und wieder in wässrigen Puffern aufgenommen (in einem geringeren Volumen als dem Ausgangsvolumen).
10. Elektrophorese
10.1. Native Gelelektrophorese
11. Fällung
11.1. Prinzip
11.2. Methoden
11.2.1. Aussalzen
11.2.2. Isoelektrische Präzipation
11.2.3. Fällung mit organischen Lösungsmitteln
12. Proteinisolierung
12.1. Zentrifugation
12.1.1. Prinzip
12.1.1.1. Zentrifugen nutzen die Massenträgheit im Zentrifugiergutraum zur Stofftrennung. Partikel oder Medien mit höherer Dichte wandern aufgrund der höheren Trägheit nach außen. Dabei verdrängen sie die Bestandteile mit niedrigerer Dichte, die hierdurch zur Mitte gelangen. Der Prozess ist gegenüber der Sedimentation durch die Schwerkraft wesentlich schneller oder wird überhaupt erst möglich
12.1.1.1.1. Differentielle Zentrifugation
12.1.1.1.2. Dichtegradienten
12.1.1.1.3. Wanderung der zu Trennenden Stoffe nach außen, bis sie in dem Gradientenlösungsmittel (Dichtegradient) im Gleichgewicht stehen. Es folgt eine bessere Trennung der (mehr als 2) Phasen.
12.2. Extraktion
12.3. Filtration
12.4. Dialyse
12.4.1. Trennprinzip: Dichte/Größe
12.4.2. Chemgapedia Link
13. Chromatographie
13.1. Ionenaustausch-ch.
13.1.1. Ladung
13.1.1.1. Vorteile
13.1.1.2. Nachteile
13.2. Ausschluss-ch.
13.2.1. Größe/Dichte
13.2.1.1. Vorteile
13.2.1.1.1. einfache Handhabung
13.2.1.1.2. keine Denaturierung
13.2.1.2. Nachteile
13.2.1.2.1. geringe Selektivität
13.2.1.2.2. geringe Kapazität
13.3. Verteilungs-ch.
13.3.1. Hydrophobizität/ Polarität
13.3.1.1. Vorteile
13.3.1.1.1. als HPLC sehr hohe Ausflösung
13.3.1.2. Nachteile
13.3.1.2.1. Denaturierung wahrscheinlich
13.3.1.2.2. geringen Kapazität
13.4. Affinitäts-ch.
13.4.1. Affinität
13.4.1.1. Vorteile
13.4.1.1.1. sehr spezifische Abtrennung
13.4.1.1.2. hohe Kapazität möglich
13.4.1.2. Nachteile
13.4.1.2.1. teils schwierige Elution
13.5. Adsorptions-ch.
13.5.1. Affinität
13.5.2. Hydrophobizität/ Affinität
13.6. Prinzip
13.6.1. Die Funktionsweise und damit die Frage nach der richtigen Wahl der Methode werden über Charakteristika von Matrix, Eluent/Eluenten und Analyt/Analyten festgelegt
14. unspezifische Nachweise über Fluoreszenz
14.1. Reaktion mit Fluoraldehyd (OPA)
14.2. Reaktion mit Fluorescamin
14.3. Reaktion mit NHS (N-Hydroxysuccinimid)
14.4. Epicocconone/Deep Purple
15. SDS PAGE
15.1. > "Sodium dodecylsulfate polyacrylamid gel electrophoresis" > Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht unter denaturierenden Bedingungen > Tensid SDS überdeckt Eigenladungen der Proteine > konstantes Ladungs-Masse-Verhältnis >
15.1.1. Vorteile SDS PAGE: >Proteinaggregation wird verhindert >schnelle Trennungen, da die Micellen hohe Ladungen tragen >Trennung erfolgt nur nach einem Parameter (Molekulargewicht) >Es gehen auch sehr hydrophobe und denaturierte Proteine in Lösung
16. Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung
16.1. Nachteil: wenig empfindlich
16.2. Vorteil: schnell
17. Vorteil: keine Eichung notwendig
18. Protein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bildenProtein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.
19. spezifische Proteinnachweise in Lösung
19.1. Detektion Hydrolasen
19.1.1. Lipasen
19.1.2. Peptidasen und Proteasen
19.1.3. Esterasen
19.1.4. Glycosidasen
19.1.5. sonstige Hydrolasen
19.2. Nachteil: sehr störanfällig
19.3. Detektion Oxido-Reduktasen
19.3.1. Dehydrogenasen
19.3.2. Peroxidase
19.3.3. Katalase
20. Anregung von leicht anregbaren pi-Elektronen
20.1. 205 nm
20.1.1. n-pi*-Absorption der Peptidbindung
20.2. 280 nm
20.2.1. pi-pi*-Absorption aromatischer AS
20.2.2. Vorteil: keine Eichung notwendig
21. Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung
21.1. Nachteile: langsam, Färbung nicht stabil
22. Grundsätzlich unterscheidet man zwei Arten von Extraktion. Die flüssig-flüssig Extraktion und die Feststoffextraktion. Das Extraktionsverfahren ist im Prinzip bei beiden Extraktions-Arten das gleiche und läuft wie folgt ab. Man hat ein Gemisch aus 2 nichtmischbaren Flüssigkeiten bzw. ein Feststoffgemisch bei dem ein Stoff an/in einer Komponente anhaftet. Man nennt dieses Flüssigkeitsgemisch bzw. Feststoffgemisch das Extraktionsgut. Dem Gemisch wird ein Lösemittel, das Extraktionsmittel, zugegeben welches einen Stoff des Ausgangsgemisches (Extraktionsgut) bevorzugt löst. Durch kräftiges durchmischen des Extraktionsgutes zusammen mit dem Extraktions-mittel löst das Extraktionsmittel einen Stoff heraus. Man sagt das Extraktionsmittel ist nun mit Extrakt (herausgelöster Stoff) beladen. Nun muss das mit Extrakt beladene Extraktionsmittel noch gewonnen werden. Es muss also vom Rest des Gemisches durch ein Trennverfahren isoliert werden. Ist dies geschehen erhält man die Extraktionslösung (beladenes Extraktionsmittel) und einen Extraktionsrückstand (das Ausgangsgemisch aus dem der Stoff herausgelöst wurde).
22.1. Bei der Fällung wird die Sättigungskonzentration der gelösten Substanz bzw. deren Löslichkeitsprodukt überschritten, ausgelöst durch Zugabe einer leichter löslichen Substanz, Änderung der Lösungsmittel zur wässrigen oder durch Zugabe einer zweiten Reaktionslösung mit anschließender Fällungsreaktion. Die Fällungsreaktion ist eine chemische Reaktion, bei der die Edukte im vorliegenden Lösungsmittel in gelöster Form vorliegen, eines der Produkte jedoch im verwendeten Lösungsmittel unlöslich oder schwerlöslich ist und somit als Feststoff (Niederschlag) ausfällt.
23. > Trennung nach positiven und negativen Ladungen innerhalb des Proteins > IEP: Punkt, an dem Molekül gleich viele positive und negative Ladungen > Moleküle wandern innerhalb pH-Gradient zu Stelle des IEP in Trenngel > alle Moleküle einer Sorte sammeln sich an einer Stelle = Fokussierung > Trennung von Isomeren möglich > Feststellen des IEP
24. Proteinnachweis
24.1. qualitative Methoden
24.1.1. Elektrophorese + Western Blot
24.1.1.1. Western Blot
24.1.1.2. Elektrophorese
24.1.2. Immunhistochemie
24.1.3. Enzymhistochemie
24.1.4. Bioassay
24.1.5. Protein-Array
24.1.6. Protein-Tags
24.1.7. Sonderformen
24.1.7.1. Reporter-Proteine
24.2. quantitative Methoden
24.2.1. spektrometrisch
24.2.1.1. UV-Vis
24.2.2. kolorimetrisch
24.2.2.1. Lowry-Test
24.2.2.2. Biuret-Test
24.2.2.3. Bradford-Test
24.2.2.3.1. Coomassie-Bindung an basische und aromatische AS
24.2.2.4. Sonderformen
24.2.2.4.1. Ninhydrin
24.2.2.4.2. Indocyangrün
24.2.3. BCA-Test
24.3. quantitativ und qualitativ
24.3.1. ELISA