Proteinbiochemische Methoden

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Proteinbiochemische Methoden by Mind Map: Proteinbiochemische Methoden

1. ohne Ligand nicht einsetzbar

2. unspezifische Nachweise über Fluoreszenz

2.1. Reaktion mit Fluoraldehyd (OPA)

2.2. Reaktion mit Fluorescamin

2.3. Reaktion mit NHS (N-Hydroxysuccinimid)

2.4. Epicocconone/Deep Purple

3. Vorteile: > wenig zeitaufwendige Technik zur Analyse von PCR-Produkten > Gel ist leicht gießbar und denaturiert nicht in den Proben Nachteile: > Gel kann während Elektrophorese schmelzen, Puffer erschöpft, Genmaterial läuft nicht immer gleich (schnell)

4. Als allgemeines Prinzip nutzt jede Chromatographie die Unterschiede in der Verteilung des Analyten auf eine mobile und eine Stationäre Phase

5. > Trennung nach Ladung und Form/Größe im elektrischen Feld > poröses Gel in ionischer Pufferlsg. > Proteinfaltung bleibt erhalten > !Handhabung und Analyse schwierig! > keine Trennung nach Masse, nur IEP und hydrodyn. Volumen

6. Isoelektrische Fokussierung

7. SDS PAGE

7.1. > "Sodium dodecylsulfate polyacrylamid gel electrophoresis" > Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht unter denaturierenden Bedingungen > Tensid SDS überdeckt Eigenladungen der Proteine > konstantes Ladungs-Masse-Verhältnis >

7.1.1. Vorteile SDS PAGE: >Proteinaggregation wird verhindert >schnelle Trennungen, da die Micellen hohe Ladungen tragen >Trennung erfolgt nur nach einem Parameter (Molekulargewicht) >Es gehen auch sehr hydrophobe und denaturierte Proteine in Lösung

8. Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung

8.1. Nachteil: wenig empfindlich

8.2. Vorteil: schnell

9. Eine verbleibende Nettoladung auf der Proteinoberfläche verursacht eine elektrostatische Abstoßung der Proteine in Lösung. Zur Aggregation muss diese Abstoßung überwunden werden. Die Barriere kann durch eine Verschiebung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt (pI-Wert) eines Proteins verringert werden. Fast alle Proteine weisen bei ihrem pI-Wert die geringste Löslichkeit auf, und in vielen Fällen kann eine Fällung beobachtet werden. Es gibt aber auch Proteine, die an diesem Punkt gut löslich sind, z.B. die Albumine.

10. Trennverfahren bei der Reinigung von Proteinen. Proteine liegen nur in Lösung vor, wenn sie über eine ausreichende Hydrathülle verfügen. Wenn Salze zugesetzt werden binden die Ionen Wassermoleküle in ihrer Hydrathülle und entziehen sie den Proteinmolekülen. Geschwindigkeit abhängig von Salz und Protein.

11. Osmose durch semipermeable Membran: Abtrennung niedermolekularer Substanzen

12. Proteine können mit kaltem Aceton oder kurzkettigen Alkoholen (Ethanol) gefällt werden. Längerkettige würden durch die entstehende Phasengrenzfläche denaturierend auf Proteine wirken. Welches Lösungsmittel sich am besten für die Fällung eines spezifischen Proteins eignet, muss durch das Experiment geklärt werden. Das Lösungsmittel sollte langsam zudosiert werden, um hohe lokale Konzentrationen zu vermeiden, was eine Denaturierung zur Folge haben kann – aber nicht muss. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation pelletiert und wieder in wässrigen Puffern aufgenommen (in einem geringeren Volumen als dem Ausgangsvolumen).

13. Vorteil: keine Eichung notwendig

14. Elektrophorese

14.1. Native Gelelektrophorese

15. Protein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bildenProtein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.

16. Fällung

16.1. Prinzip

16.2. Methoden

16.2.1. Aussalzen

16.2.2. Isoelektrische Präzipation

16.2.3. Fällung mit organischen Lösungsmitteln

17. spezifische Proteinnachweise in Lösung

17.1. Detektion Hydrolasen

17.1.1. Lipasen

17.1.2. Peptidasen und Proteasen

17.1.3. Esterasen

17.1.4. Glycosidasen

17.1.5. sonstige Hydrolasen

17.2. Nachteil: sehr störanfällig

17.3. Detektion Oxido-Reduktasen

17.3.1. Dehydrogenasen

17.3.2. Peroxidase

17.3.3. Katalase

18. Anregung von leicht anregbaren pi-Elektronen

18.1. 205 nm

18.1.1. n-pi*-Absorption der Peptidbindung

18.2. 280 nm

18.2.1. pi-pi*-Absorption aromatischer AS

18.2.2. Vorteil: keine Eichung notwendig

19. Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung

19.1. Nachteile: langsam, Färbung nicht stabil

20. Grundsätzlich unterscheidet man zwei Arten von Extraktion. Die flüssig-flüssig Extraktion und die Feststoffextraktion. Das Extraktionsverfahren ist im Prinzip bei beiden Extraktions-Arten das gleiche und läuft wie folgt ab. Man hat ein Gemisch aus 2 nichtmischbaren Flüssigkeiten bzw. ein Feststoffgemisch bei dem ein Stoff an/in einer Komponente anhaftet. Man nennt dieses Flüssigkeitsgemisch bzw. Feststoffgemisch das Extraktionsgut. Dem Gemisch wird ein Lösemittel, das Extraktionsmittel, zugegeben welches einen Stoff des Ausgangsgemisches (Extraktionsgut) bevorzugt löst. Durch kräftiges durchmischen des Extraktionsgutes zusammen mit dem Extraktions-mittel löst das Extraktionsmittel einen Stoff heraus. Man sagt das Extraktionsmittel ist nun mit Extrakt (herausgelöster Stoff) beladen. Nun muss das mit Extrakt beladene Extraktionsmittel noch gewonnen werden. Es muss also vom Rest des Gemisches durch ein Trennverfahren isoliert werden. Ist dies geschehen erhält man die Extraktionslösung (beladenes Extraktionsmittel) und einen Extraktionsrückstand (das Ausgangsgemisch aus dem der Stoff herausgelöst wurde).

20.1. Bei der Fällung wird die Sättigungskonzentration der gelösten Substanz bzw. deren Löslichkeitsprodukt überschritten, ausgelöst durch Zugabe einer leichter löslichen Substanz, Änderung der Lösungsmittel zur wässrigen oder durch Zugabe einer zweiten Reaktionslösung mit anschließender Fällungsreaktion. Die Fällungsreaktion ist eine chemische Reaktion, bei der die Edukte im vorliegenden Lösungsmittel in gelöster Form vorliegen, eines der Produkte jedoch im verwendeten Lösungsmittel unlöslich oder schwerlöslich ist und somit als Feststoff (Niederschlag) ausfällt.

21. > Trennung nach positiven und negativen Ladungen innerhalb des Proteins > IEP: Punkt, an dem Molekül gleich viele positive und negative Ladungen > Moleküle wandern innerhalb pH-Gradient zu Stelle des IEP in Trenngel > alle Moleküle einer Sorte sammeln sich an einer Stelle = Fokussierung > Trennung von Isomeren möglich > Feststellen des IEP

22. Proteinisolierung

22.1. Zentrifugation

22.1.1. Prinzip

22.1.1.1. Zentrifugen nutzen die Massenträgheit im Zentrifugiergutraum zur Stofftrennung. Partikel oder Medien mit höherer Dichte wandern aufgrund der höheren Trägheit nach außen. Dabei verdrängen sie die Bestandteile mit niedrigerer Dichte, die hierdurch zur Mitte gelangen. Der Prozess ist gegenüber der Sedimentation durch die Schwerkraft wesentlich schneller oder wird überhaupt erst möglich

22.1.1.1.1. Differentielle Zentrifugation

22.1.1.1.2. Dichtegradienten

22.1.1.1.3. Wanderung der zu Trennenden Stoffe nach außen, bis sie in dem Gradientenlösungsmittel (Dichtegradient) im Gleichgewicht stehen. Es folgt eine bessere Trennung der (mehr als 2) Phasen.

22.2. Extraktion

22.3. Filtration

22.4. Dialyse

22.4.1. Trennprinzip: Dichte/Größe

22.4.2. Chemgapedia Link

23. Proteinnachweis

23.1. qualitative Methoden

23.1.1. Elektrophorese + Western Blot

23.1.1.1. Western Blot

23.1.1.2. Elektrophorese

23.1.2. Immunhistochemie

23.1.3. Enzymhistochemie

23.1.4. Bioassay

23.1.5. Protein-Array

23.1.6. Protein-Tags

23.1.7. Sonderformen

23.1.7.1. Reporter-Proteine

23.2. quantitative Methoden

23.2.1. spektrometrisch

23.2.1.1. UV-Vis

23.2.2. kolorimetrisch

23.2.2.1. Lowry-Test

23.2.2.2. Biuret-Test

23.2.2.3. Bradford-Test

23.2.2.3.1. Coomassie-Bindung an basische und aromatische AS

23.2.2.4. Sonderformen

23.2.2.4.1. Ninhydrin

23.2.2.4.2. Indocyangrün

23.2.3. BCA-Test

23.3. quantitativ und qualitativ

23.3.1. ELISA

24. Chromatographie

24.1. Ionenaustausch-ch.

24.1.1. Ladung

24.1.1.1. Vorteile

24.1.1.2. Nachteile

24.2. Ausschluss-ch.

24.2.1. Größe/Dichte

24.2.1.1. Vorteile

24.2.1.1.1. einfache Handhabung

24.2.1.1.2. keine Denaturierung

24.2.1.2. Nachteile

24.2.1.2.1. geringe Selektivität

24.2.1.2.2. geringe Kapazität

24.3. Verteilungs-ch.

24.3.1. Hydrophobizität/ Polarität

24.3.1.1. Vorteile

24.3.1.1.1. als HPLC sehr hohe Ausflösung

24.3.1.2. Nachteile

24.3.1.2.1. Denaturierung wahrscheinlich

24.3.1.2.2. geringen Kapazität

24.4. Affinitäts-ch.

24.4.1. Affinität

24.4.1.1. Vorteile

24.4.1.1.1. sehr spezifische Abtrennung

24.4.1.1.2. hohe Kapazität möglich

24.4.1.2. Nachteile

24.4.1.2.1. teils schwierige Elution

24.5. Adsorptions-ch.

24.5.1. Affinität

24.5.2. Hydrophobizität/ Affinität

24.6. Prinzip

24.6.1. Die Funktionsweise und damit die Frage nach der richtigen Wahl der Methode werden über Charakteristika von Matrix, Eluent/Eluenten und Analyt/Analyten festgelegt