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Proteinbiochemische Methoden by Mind Map: Proteinbiochemische Methoden
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Proteinbiochemische Methoden

ohne Ligand nicht einsetzbar

unspezifische Nachweise über Fluoreszenz

Reaktion mit Fluoraldehyd (OPA)

Reaktion mit Fluorescamin

Reaktion mit NHS (N-Hydroxysuccinimid)

Epicocconone/Deep Purple

Vorteile: > wenig zeitaufwendige Technik zur Analyse von PCR-Produkten > Gel ist leicht gießbar und denaturiert nicht in den Proben Nachteile: > Gel kann während Elektrophorese schmelzen, Puffer erschöpft, Genmaterial läuft nicht immer gleich (schnell)

Als allgemeines Prinzip nutzt jede Chromatographie die Unterschiede in der Verteilung des Analyten auf eine mobile und eine Stationäre Phase

> Trennung nach Ladung und Form/Größe im elektrischen Feld > poröses Gel in ionischer Pufferlsg. > Proteinfaltung bleibt erhalten > !Handhabung und Analyse schwierig! > keine Trennung nach Masse, nur IEP und hydrodyn. Volumen

Isoelektrische Fokussierung

SDS PAGE

> "Sodium dodecylsulfate polyacrylamid gel electrophoresis" > Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht unter denaturierenden Bedingungen > Tensid SDS überdeckt Eigenladungen der Proteine > konstantes Ladungs-Masse-Verhältnis >

Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung

Nachteil: wenig empfindlich

Vorteil: schnell

Eine verbleibende Nettoladung auf der Proteinoberfläche verursacht eine elektrostatische Abstoßung der Proteine in Lösung. Zur Aggregation muss diese Abstoßung überwunden werden. Die Barriere kann durch eine Verschiebung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt (pI-Wert) eines Proteins verringert werden. Fast alle Proteine weisen bei ihrem pI-Wert die geringste Löslichkeit auf, und in vielen Fällen kann eine Fällung beobachtet werden. Es gibt aber auch Proteine, die an diesem Punkt gut löslich sind, z.B. die Albumine.

Trennverfahren bei der Reinigung von Proteinen. Proteine liegen nur in Lösung vor, wenn sie über eine ausreichende Hydrathülle verfügen. Wenn Salze zugesetzt werden binden die Ionen Wassermoleküle in ihrer Hydrathülle und entziehen sie den Proteinmolekülen. Geschwindigkeit abhängig von Salz und Protein.

Osmose durch semipermeable Membran: Abtrennung niedermolekularer Substanzen

Proteine können mit kaltem Aceton oder kurzkettigen Alkoholen (Ethanol) gefällt werden. Längerkettige würden durch die entstehende Phasengrenzfläche denaturierend auf Proteine wirken. Welches Lösungsmittel sich am besten für die Fällung eines spezifischen Proteins eignet, muss durch das Experiment geklärt werden. Das Lösungsmittel sollte langsam zudosiert werden, um hohe lokale Konzentrationen zu vermeiden, was eine Denaturierung zur Folge haben kann – aber nicht muss. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation pelletiert und wieder in wässrigen Puffern aufgenommen (in einem geringeren Volumen als dem Ausgangsvolumen).

Vorteil: keine Eichung notwendig

Elektrophorese

Native Gelelektrophorese

gel electrophoresis

Protein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bildenProtein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.

Fällung

Prinzip

Methoden

spezifische Proteinnachweise in Lösung

Detektion Hydrolasen

Nachteil: sehr störanfällig

Detektion Oxido-Reduktasen

Anregung von leicht anregbaren pi-Elektronen

205 nm

280 nm

Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung

Nachteile: langsam, Färbung nicht stabil

Grundsätzlich unterscheidet man zwei Arten von Extraktion. Die flüssig-flüssig Extraktion und die Feststoffextraktion. Das Extraktionsverfahren ist im Prinzip bei beiden Extraktions-Arten das gleiche und läuft wie folgt ab. Man hat ein Gemisch aus 2 nichtmischbaren Flüssigkeiten bzw. ein Feststoffgemisch bei dem ein Stoff an/in einer Komponente anhaftet. Man nennt dieses Flüssigkeitsgemisch bzw. Feststoffgemisch das Extraktionsgut. Dem Gemisch wird ein Lösemittel, das Extraktionsmittel, zugegeben welches einen Stoff des Ausgangsgemisches (Extraktionsgut) bevorzugt löst. Durch kräftiges durchmischen des Extraktionsgutes zusammen mit dem Extraktions-mittel löst das Extraktionsmittel einen Stoff heraus. Man sagt das Extraktionsmittel ist nun mit Extrakt (herausgelöster Stoff) beladen. Nun muss das mit Extrakt beladene Extraktionsmittel noch gewonnen werden. Es muss also vom Rest des Gemisches durch ein Trennverfahren isoliert werden. Ist dies geschehen erhält man die Extraktionslösung (beladenes Extraktionsmittel) und einen Extraktionsrückstand (das Ausgangsgemisch aus dem der Stoff herausgelöst wurde).

Bei der Fällung wird die Sättigungskonzentration der gelösten Substanz bzw. deren Löslichkeitsprodukt überschritten, ausgelöst durch Zugabe einer leichter löslichen Substanz, Änderung der Lösungsmittel zur wässrigen oder durch Zugabe einer zweiten Reaktionslösung mit anschließender Fällungsreaktion. Die Fällungsreaktion ist eine chemische Reaktion, bei der die Edukte im vorliegenden Lösungsmittel in gelöster Form vorliegen, eines der Produkte jedoch im verwendeten Lösungsmittel unlöslich oder schwerlöslich ist und somit als Feststoff (Niederschlag) ausfällt.

> Trennung nach positiven und negativen Ladungen innerhalb des Proteins > IEP: Punkt, an dem Molekül gleich viele positive und negative Ladungen > Moleküle wandern innerhalb pH-Gradient zu Stelle des IEP in Trenngel > alle Moleküle einer Sorte sammeln sich an einer Stelle = Fokussierung > Trennung von Isomeren möglich > Feststellen des IEP

Proteinisolierung

Zentrifugation

Extraktion

Filtration

Dialyse

Proteinnachweis

qualitative Methoden

quantitative Methoden

quantitativ und qualitativ

Chromatographie

Ionenaustausch-ch.

Ausschluss-ch.

Verteilungs-ch.

Affinitäts-ch.

Adsorptions-ch.

Prinzip