1. ohne Ligand nicht einsetzbar
2. unspezifische Nachweise über Fluoreszenz
2.1. Reaktion mit Fluoraldehyd (OPA)
2.2. Reaktion mit Fluorescamin
2.3. Reaktion mit NHS (N-Hydroxysuccinimid)
2.4. Epicocconone/Deep Purple
3. Vorteile: > wenig zeitaufwendige Technik zur Analyse von PCR-Produkten > Gel ist leicht gießbar und denaturiert nicht in den Proben Nachteile: > Gel kann während Elektrophorese schmelzen, Puffer erschöpft, Genmaterial läuft nicht immer gleich (schnell)
4. Als allgemeines Prinzip nutzt jede Chromatographie die Unterschiede in der Verteilung des Analyten auf eine mobile und eine Stationäre Phase
5. > Trennung nach Ladung und Form/Größe im elektrischen Feld > poröses Gel in ionischer Pufferlsg. > Proteinfaltung bleibt erhalten > !Handhabung und Analyse schwierig! > keine Trennung nach Masse, nur IEP und hydrodyn. Volumen
6. Isoelektrische Fokussierung
7. SDS PAGE
7.1. > "Sodium dodecylsulfate polyacrylamid gel electrophoresis" > Trennung von Proteinen nach Molekulargewicht unter denaturierenden Bedingungen > Tensid SDS überdeckt Eigenladungen der Proteine > konstantes Ladungs-Masse-Verhältnis >
7.1.1. Vorteile SDS PAGE: >Proteinaggregation wird verhindert >schnelle Trennungen, da die Micellen hohe Ladungen tragen >Trennung erfolgt nur nach einem Parameter (Molekulargewicht) >Es gehen auch sehr hydrophobe und denaturierte Proteine in Lösung
8. Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung
8.1. Nachteil: wenig empfindlich
8.2. Vorteil: schnell
9. Eine verbleibende Nettoladung auf der Proteinoberfläche verursacht eine elektrostatische Abstoßung der Proteine in Lösung. Zur Aggregation muss diese Abstoßung überwunden werden. Die Barriere kann durch eine Verschiebung des pH-Wertes auf den isoelektrischen Punkt (pI-Wert) eines Proteins verringert werden. Fast alle Proteine weisen bei ihrem pI-Wert die geringste Löslichkeit auf, und in vielen Fällen kann eine Fällung beobachtet werden. Es gibt aber auch Proteine, die an diesem Punkt gut löslich sind, z.B. die Albumine.
10. Trennverfahren bei der Reinigung von Proteinen. Proteine liegen nur in Lösung vor, wenn sie über eine ausreichende Hydrathülle verfügen. Wenn Salze zugesetzt werden binden die Ionen Wassermoleküle in ihrer Hydrathülle und entziehen sie den Proteinmolekülen. Geschwindigkeit abhängig von Salz und Protein.
11. Osmose durch semipermeable Membran: Abtrennung niedermolekularer Substanzen
12. Proteine können mit kaltem Aceton oder kurzkettigen Alkoholen (Ethanol) gefällt werden. Längerkettige würden durch die entstehende Phasengrenzfläche denaturierend auf Proteine wirken. Welches Lösungsmittel sich am besten für die Fällung eines spezifischen Proteins eignet, muss durch das Experiment geklärt werden. Das Lösungsmittel sollte langsam zudosiert werden, um hohe lokale Konzentrationen zu vermeiden, was eine Denaturierung zur Folge haben kann – aber nicht muss. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation pelletiert und wieder in wässrigen Puffern aufgenommen (in einem geringeren Volumen als dem Ausgangsvolumen).
13. Vorteil: keine Eichung notwendig
14. Elektrophorese
14.1. Native Gelelektrophorese
15. Protein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden vermutlich zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bildenProtein bildet mit Cu2+-Ionen in alkalischer Lösung einen Komplex (Biuret-Reaktion). Die Cu2+- Ionen des Komplexes werden zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchonininsäure (BCA) einen violetten Farbkomplex bilden.
16. Fällung
16.1. Prinzip
16.2. Methoden
16.2.1. Aussalzen
16.2.2. Isoelektrische Präzipation
16.2.3. Fällung mit organischen Lösungsmitteln
17. spezifische Proteinnachweise in Lösung
17.1. Detektion Hydrolasen
17.1.1. Lipasen
17.1.2. Peptidasen und Proteasen
17.1.3. Esterasen
17.1.4. Glycosidasen
17.1.5. sonstige Hydrolasen
17.2. Nachteil: sehr störanfällig
17.3. Detektion Oxido-Reduktasen
17.3.1. Dehydrogenasen
17.3.2. Peroxidase
17.3.3. Katalase
18. Anregung von leicht anregbaren pi-Elektronen
18.1. 205 nm
18.1.1. n-pi*-Absorption der Peptidbindung
18.2. 280 nm
18.2.1. pi-pi*-Absorption aromatischer AS
18.2.2. Vorteil: keine Eichung notwendig
19. Reaktion Cu-Ionen mit Peptidbindung
19.1. Nachteile: langsam, Färbung nicht stabil
20. Grundsätzlich unterscheidet man zwei Arten von Extraktion. Die flüssig-flüssig Extraktion und die Feststoffextraktion. Das Extraktionsverfahren ist im Prinzip bei beiden Extraktions-Arten das gleiche und läuft wie folgt ab. Man hat ein Gemisch aus 2 nichtmischbaren Flüssigkeiten bzw. ein Feststoffgemisch bei dem ein Stoff an/in einer Komponente anhaftet. Man nennt dieses Flüssigkeitsgemisch bzw. Feststoffgemisch das Extraktionsgut. Dem Gemisch wird ein Lösemittel, das Extraktionsmittel, zugegeben welches einen Stoff des Ausgangsgemisches (Extraktionsgut) bevorzugt löst. Durch kräftiges durchmischen des Extraktionsgutes zusammen mit dem Extraktions-mittel löst das Extraktionsmittel einen Stoff heraus. Man sagt das Extraktionsmittel ist nun mit Extrakt (herausgelöster Stoff) beladen. Nun muss das mit Extrakt beladene Extraktionsmittel noch gewonnen werden. Es muss also vom Rest des Gemisches durch ein Trennverfahren isoliert werden. Ist dies geschehen erhält man die Extraktionslösung (beladenes Extraktionsmittel) und einen Extraktionsrückstand (das Ausgangsgemisch aus dem der Stoff herausgelöst wurde).
20.1. Bei der Fällung wird die Sättigungskonzentration der gelösten Substanz bzw. deren Löslichkeitsprodukt überschritten, ausgelöst durch Zugabe einer leichter löslichen Substanz, Änderung der Lösungsmittel zur wässrigen oder durch Zugabe einer zweiten Reaktionslösung mit anschließender Fällungsreaktion. Die Fällungsreaktion ist eine chemische Reaktion, bei der die Edukte im vorliegenden Lösungsmittel in gelöster Form vorliegen, eines der Produkte jedoch im verwendeten Lösungsmittel unlöslich oder schwerlöslich ist und somit als Feststoff (Niederschlag) ausfällt.
21. > Trennung nach positiven und negativen Ladungen innerhalb des Proteins > IEP: Punkt, an dem Molekül gleich viele positive und negative Ladungen > Moleküle wandern innerhalb pH-Gradient zu Stelle des IEP in Trenngel > alle Moleküle einer Sorte sammeln sich an einer Stelle = Fokussierung > Trennung von Isomeren möglich > Feststellen des IEP
22. Proteinisolierung
22.1. Zentrifugation
22.1.1. Prinzip
22.1.1.1. Zentrifugen nutzen die Massenträgheit im Zentrifugiergutraum zur Stofftrennung. Partikel oder Medien mit höherer Dichte wandern aufgrund der höheren Trägheit nach außen. Dabei verdrängen sie die Bestandteile mit niedrigerer Dichte, die hierdurch zur Mitte gelangen. Der Prozess ist gegenüber der Sedimentation durch die Schwerkraft wesentlich schneller oder wird überhaupt erst möglich
22.1.1.1.1. Differentielle Zentrifugation
22.1.1.1.2. Dichtegradienten
22.1.1.1.3. Wanderung der zu Trennenden Stoffe nach außen, bis sie in dem Gradientenlösungsmittel (Dichtegradient) im Gleichgewicht stehen. Es folgt eine bessere Trennung der (mehr als 2) Phasen.
22.2. Extraktion
22.3. Filtration
22.4. Dialyse
22.4.1. Trennprinzip: Dichte/Größe
22.4.2. Chemgapedia Link
23. Proteinnachweis
23.1. qualitative Methoden
23.1.1. Elektrophorese + Western Blot
23.1.1.1. Western Blot
23.1.1.2. Elektrophorese
23.1.2. Immunhistochemie
23.1.3. Enzymhistochemie
23.1.4. Bioassay
23.1.5. Protein-Array
23.1.6. Protein-Tags
23.1.7. Sonderformen
23.1.7.1. Reporter-Proteine
23.2. quantitative Methoden
23.2.1. spektrometrisch
23.2.1.1. UV-Vis
23.2.2. kolorimetrisch
23.2.2.1. Lowry-Test
23.2.2.2. Biuret-Test
23.2.2.3. Bradford-Test
23.2.2.3.1. Coomassie-Bindung an basische und aromatische AS
23.2.2.4. Sonderformen
23.2.2.4.1. Ninhydrin
23.2.2.4.2. Indocyangrün
23.2.3. BCA-Test
23.3. quantitativ und qualitativ
23.3.1. ELISA
24. Chromatographie
24.1. Ionenaustausch-ch.
24.1.1. Ladung
24.1.1.1. Vorteile
24.1.1.2. Nachteile
24.2. Ausschluss-ch.
24.2.1. Größe/Dichte
24.2.1.1. Vorteile
24.2.1.1.1. einfache Handhabung
24.2.1.1.2. keine Denaturierung
24.2.1.2. Nachteile
24.2.1.2.1. geringe Selektivität
24.2.1.2.2. geringe Kapazität
24.3. Verteilungs-ch.
24.3.1. Hydrophobizität/ Polarität
24.3.1.1. Vorteile
24.3.1.1.1. als HPLC sehr hohe Ausflösung
24.3.1.2. Nachteile
24.3.1.2.1. Denaturierung wahrscheinlich
24.3.1.2.2. geringen Kapazität
24.4. Affinitäts-ch.
24.4.1. Affinität
24.4.1.1. Vorteile
24.4.1.1.1. sehr spezifische Abtrennung
24.4.1.1.2. hohe Kapazität möglich
24.4.1.2. Nachteile
24.4.1.2.1. teils schwierige Elution
24.5. Adsorptions-ch.
24.5.1. Affinität
24.5.2. Hydrophobizität/ Affinität
24.6. Prinzip
24.6.1. Die Funktionsweise und damit die Frage nach der richtigen Wahl der Methode werden über Charakteristika von Matrix, Eluent/Eluenten und Analyt/Analyten festgelegt